男科学实验室诊断进展

关于男科学实验室诊断进展第1页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五

精液分析是评价男性生育能力的最基本检验手段。理论上，精液分析是一个很简单的操作过程，只要将一滴精液置于玻片上，进而确定其相关参数即可。然而，实际上，精液分析所得的每一个参数都需要大量的专业知识、细致认真的操作及必要的质量控制措施。第2页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五

Keel等报告了美国纽约、哥伦比亚、洛山矶、明尼苏达几百家男科实验室对精子密度、形态学、活率及抗精子抗体的室间质量控制结果，精子密度的结果显示，一份精液标本的精子密度差异范围达3~492×106/ml，手工检测的变异系数（CV）为30%~138%，计算机辅助的精液分析（CASA）的CV为24%~99%。不同实验室精子密度的较大差异提示，精子计数方法的不同、计数池种类的不同以及操作的标准化对精子计数结果有着直接的影响。第3页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五一、精液常规检查

1、精液检测工具不断更新（1）血细胞计数板沿用50余年

（2）Makler精子计数板1978年以色列Makler发明（3）Macro精子计数板（4）Microcell计数池1990年Ginabury和Armand发明一次性使用（5）2004年，美国MillenniumSciences公司Cell-VU精子记数池和Cell-VU预染色形态载波片。

第4页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五计算机辅助的精液分析

80年代发展的新技术，除可分析精子密度、活动百分率等指标外，在分析精子运动能力方面显示了其独特的优越性。第5页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五第6页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五第7页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五第8页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五第9页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五第10页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五第11页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五第12页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五全自动精子分析仪（以色列）MedicalElectronicSystems第13页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五

用已知浓度的乳胶珠溶液对目前国际上常用的３种精子计数池进行了评价。

３种精子计数池的质量评估第14页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五1材料与方法1.1实验材料

Cell-VU计数池（MillenniumSciencesInc，NewYork，USA）Makler计数池（Sefi-MedicalInstrument，Haifa，Israel）血球计数池（上海求精生化试剂仪器有限公司）标准乳胶珠溶液（HamiltonThorneBiosciences，USA）2份，浓度分别为：（35±5）×106/ml，（18±2.5）×106/ml。第15页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五1.２方法1.2.1Cell-VU计数法1.2.2Makler计数法1.2.3血球计数池法1.３统计学分析

不同计数池的计数结果以x±s表示，样本均数的比较采用t检验

第16页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五2结果ChambernConcentrationforstandardsolution1Concentrationforstandardsolution2Cell-VU3037.63±4.8918.22±1.77Hemacytometer3042.74±4.98*20.48±1.56*Makler1553.52±6.67*△24.97±4.75*△表1不同精子计数池的乳胶珠浓度与Cell-VU计数池相比，*：P<0.001；与血球计数池相比，△：P<0.001第17页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五Cell-VU计数池的浓度最接近标准乳胶珠的浓度，平均变异系数（CV）分别为7.51%和1.22%，而血球计数池的CV分别为22.11%和13.78%，Makler计数池的CV分别为52.91%和38.72%。提示，Cell-VU计数池计数结果最准确，而血球计数池和Makler计数池计数结果明显偏高，尤以Makler计数池与标准乳胶珠浓度相差最大，差异达52.91%。

第18页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五室内质控和室间质控是保证不同实验室结果准确和可靠的重要措施之一。精子计数是男科实验室目前考虑较多的质控项目之一，目前最大的挑战来自精子计数方法学的标准化和监测。本研究显示，Cell-VU计数池的准确性和精确性均优于血球计数池和Makler计数池，与文献报道一致。而且，Cell-VU可一次性或反复多次使用，这在计数传染性较强的样本时将显示出独特的优势。因此，我们建议要建立一个标准的计数池操作系统用于所有实验室，从而为不同实验室的质量控制评价提供基础，最终提高所有实验室结果的准确性和可靠性。Cell-VU应是此标准计数池的最佳选择。

第19页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五2.精子功能测定

（1）传统经典的“仓鼠卵穿刺实验”（2）精子-宫颈粘液穿透试验（3）毛细管穿透试验（4）低渗肿胀试验（5）吖啶橙染色(荧光显微镜)

（6）精子DNA完整性检测（流式细胞仪）

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精子DNA完整性检测亦称精子染色质结构分析，SCSA），是应用流式细胞仪检测精子功能的方法之一。精子发生过程中，鱼精蛋白逐步取代组蛋白与DNA结合。精子进入附睾后，鱼精蛋白的组成不再改变。但附睾中精子在逐步成熟的过程中，鱼精蛋白中大量的巯基(SH)不断被氧化成二硫键(S=S)，与DNA结合更加紧密，使DNA更具抗酸能力，维持了双链结构的稳定性。精子DNA完整性检测（流式细胞仪）第21页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五

而染色质异常的精子，鱼精蛋白中多数巯基未被氧化，在酸的作用下易变性为单链DNA。根据这一原理，用酸处理精液样品，再行吖啶橙(AO)染色，AO可与双链DNA结合呈单体形式发出绿色荧光，与单链DNA结合呈聚合物形式发出红或黄色荧光。然后通过配有专用软件的流式细胞仪可进行数据处理得出SCSA参数。精子DNA完整性检测（流式细胞仪）第22页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五二、生精细胞检查与睾丸活检1、生精细胞检查精液中除成熟的精子外，亦可见未成熟的生精细胞，包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、早期和晚期精子细胞等

生精细胞检查方法：

染色法荧光原位杂交单克隆抗体免疫组化法流式细胞术第23页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五2、睾丸活检

开放活检、细针穿刺、活检枪、高能多谱勒超声为基础的睾丸活检

70年代FSH可用放免方法测定，FSH水平可以反映生精功能受损程度，睾丸活检范围逐渐缩小，其适应证仅限于睾丸体积正常、FSH水平正常或轻度增高的无精子症病人。

80年代，精浆生化指标的测定可排除阻塞性无精子症，睾丸活检范围更小。近年来，随着显微外科的发展和显微受精技术的应用，从精液中分离一条精子即可使卵子受精达到生育目的。因此，需行睾丸活检的病例更是寥寥无几。第24页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五三、白细胞精子症的检测

精液白细胞数>1×106/ml，可诊断为白细胞精子症白细胞可通过吞噬作用、产生活性氧（ROS）、分泌一些细胞因子等途径使精子损伤。精液中粒细胞为产生ROS的主要细胞。

第25页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五精液中白细胞的检测方法；1、对ROS的检测：依赖鲁米诺的化学发光分析法2、直接镜检法3、瑞-姬染色或巴氏染色法染色4、过氧化物酶染色法（正甲苯胺兰、联苯胺及邻甲苯胺过氧化物酶染色）5、荧光原位杂交法6、免疫细胞化学法CD45，CD4，CD87、弹性蛋白酶、IL-8及溶菌酶测定

第26页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五四、免疫性不育的检测

检测方法很多，3种类别的抗精子抗体均可测，检测的抗精子抗体为总的或各种类别的抗精子膜抗原的抗体，而精子膜与人体其他器官组织的细胞膜有许多共同抗原，因而这种抗原抗体反应的特异性不高。如果用针对精子或睾丸特异性抗原，或针对与透明带识别和结合有关的抗原作为包被抗原来检测AsAb，其临床意义就会很大。

Naz等用现代分子生物学技术确定，受精抗原FA-1和YLP（12）具有此特性，并且它们的抗体存在于不育男性的精浆和血清中建立这种特异性诊断方法是今后取代总AsAb检测的唯一途径。第27页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五五、生殖道感染的检测

大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、绿脓杆菌、淋球菌、肺炎克雷伯氏菌、结核杆菌、衣原体、支原体、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、腺相关病毒、阴道毛滴虫等皆可感染生殖道，而且可致不育。各种细菌感染，往往通过菌体本身及其释放出的毒素、酶类等影响精子质量病毒的感染更为隐蔽临床实验室多用ELISA法检测各种病毒的抗体，通过抗体的分型可粗略判断病毒的感染时期第28页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五衣原体和支原体感染被认为是最常见的性传播疾病（STD）病原与男性不育密切相关的衣原体为沙眼衣原体（CT），其可引起急性附睾炎和慢性前列腺炎等。目前，检测沙眼衣原体感染的方法主要有金标法、ELISA法及培养法，尤以ELISA法最为常用与男性不育密切相关的支原体为解脲支原体临床实验室多采用培养法检测。第29页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五六、精浆生化的检测

精浆中的一些生化标志可反映男性附属性腺、附睾及睾丸生精功能等，有利于综合评价不育的发病原因和机制。例如，柠檬酸、锌、镁、谷氨酰转肽酶和酸性磷酸酶可反映前列腺功能，其中的酸性磷酸酶检测已成为男科实验室的常规检查，常用磷酸苯二钠法；

果糖与前列腺素可反映精囊腺功能，常用间苯二酚法检测果糖；

游离左旋肉毒碱、甘油磷酸胆碱和α-葡糖苷酶可反映附睾功能。第30页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五精浆总α-葡糖苷酶检测中应注意3点离心速度不同，精浆总α-葡糖苷酶活性有所差异精浆总α-葡糖苷酶活性与禁欲时间的长短密切相关精浆总α-葡糖苷酶活性的检测应进行质量控制

第31页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五不同速度离心后的精浆中α葡糖苷酶水平第32页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五禁欲时间对精浆α葡糖苷酶的影响Abstinencetime(day)nAlpha-glucosidase(U/ml)Seminalplasma(1000gfor10min)Seminalplasma(3000gfor15min)2~31236.47±12.2434.04±11.224~51649.62±16.86*47.73±17.37*6~71451.14±19.76*46.76±17.70*>8968.70±14.10*#△63.86±13.63*#△第33页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五精浆果糖检测中应注意4点：①果糖标准液配制后应放置2周后使用，而使用2周后出现吸光度降低时应立即更换新的果糖标准液②离心速度不同精浆果糖浓度稍有差异③精液液化后应立即离心将精子和精浆分离，否则会影响精浆果糖检测结果④精浆果糖测定中应引入质量控制体系第34页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五果糖标准液吸光度的监测第35页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五精液放置时间对果糖浓度的影响GroupnFructose(mmol/L)0h4815.73±6.562h4815.07±6.56a4h4814.73±6.51b,c第36页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五精浆稀释后放置时间对酸性磷酸酶活性的影响

随机选取10例精浆，1∶10000稀释后立即检测ACP活性或稀释后放置30min再次检测ACP活性，两者比较有极显著性差异（t

＝3.770，P

＝0.001）。第37页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五

抑制素B被认为是男性精子发生的血清标志物。成年男性血清中维持可检测的抑制素B水平需要生精细胞的存在，唯支持细胞综合征（SCO）男性血清抑制素B水平极低。

Brugo-Olmedo等认为血清抑制素B在预言非阻塞性无精子症病人的睾丸精子存在时比血清FSH更准确。除此之外，抑制素B还可用于儿童隐睾、性早熟的诊断，监测放、化疗对男性生精功能的损伤等。目前，抑制素B的检测通常使用双抗体夹心ELISA法。第38页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五七、精浆细胞因子的检测

精浆细胞因子由男性泌尿生殖道内的各种细胞分泌，包括转化生长因子（TGF）、表皮生长因子（EGF）、肿瘤坏死因子（TNF）、各种白细胞介素（IL）及某些可溶性受体等。目前认为，与男性不育有关的细胞因子主要有IL-6和IL-8，不育病人精浆中IL-6和IL-8水平明显高于生育力正常的男性。测定IL-6和IL-8的方法有：生物学方法、分子生物学方法和免疫学方法，以免疫学方法多用，尤以ELISA和RIA常用。

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八、精子发生相关基因的检测

与精子发生相关的基因很多，无精子病人的基因缺失均发生于Y染色体的长臂,主要位于Yq11.23中，而且并非是单一基因，可能含有整个基因大家族。

1996年，Vogt等人在更大范围对无精子、少精子病人进行了研究，认为在3个区域均存在AZF，分别为AZFa，AZFb，AZFc，对这些病人睾丸活检发现，睾丸的病理改变与AZF的缺失部位有显著相关性。

AZFa：Sy84,Sy86AZFb：Sy124，Sy127，Sy132,Sy134AZFc：Sy152，Sy157，Sy239，Sy242，Sy254，Sy255

第40页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五AZF检测：SRY存在于基因组中，Yq上的AZFa,b,c区域的位点全部丢失↓

病人正常男性正常女性空白对照第41页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五九、遗传学检测

男性不育的遗传学检测主要是检测精子染色体的异常。常规使用染色体显带技术，如G带、Q带等技术，然而其敏感度不及FISH技术

FISH技术可用于研究复杂染色体突变如性染色体异常、未知的小标志物、环状染色体、嵌合体及易位等

Y染色体长臂特异区的微缺失与不育相关第42页，共52页，2022年，5月20日，12点18分，星期五病例：46，XX/46,XY异源嵌合体导致真两性畸形腹腔镜检查发现：子宫正常大小，发育良好左右性腺均约4×