动物细胞工程Ch4课件

细胞工程云南大学生命科学学院林洁

主讲linjie@第五章

动物细胞培养的基本技术第一节

体外培养细胞的无菌操作技术第二节

原代培养和传代培养技术第三节

贴壁培养和悬浮培养技术第四节

动物细胞大规模培养技术第五节

动物细胞培养的操作方式第六节

动物细胞生物反应器大规模培养技术第七节

动物细胞培养污染的检测和排除第八节

动物细胞的冻存与复苏第一节

体外培养细胞的无菌操作技术在细胞培养过程中，一旦出现污染，可出现以下的不利影响：污染后杂菌的生长速度超过细胞生长，使培养环境完全破坏；污染后杂菌所产生的一些代谢产物，可改变培养液的某些理化性质；污染杂菌产生的代谢产物，可直接影响细胞表达产品的质量、产量和稳定性；污染杂菌将危及细胞治疗产品的安全性；在实验室内出现的污染，可能造成其他培养物和培养环境的污染。无菌技术是体外培养细胞过程中首要而且绝对重要的部分，包括3大部分：工作环境及表面的无菌；细胞培养用品与培养用液的无菌处理；实验者的无菌操作。在实验前要制定好实验计划和操作程序，有关数据的计算要事先做好；根据实验要求，准备各种所需的器材和物品，消毒后放入培养室；I.培养前的准备无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭（苯扎溴铵）脱洗地面一次（拖布要专用），紫外线照射消毒30~50min；超净工作台台面每次实验前要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦洗，然后用紫外线消毒30min。一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外照射消毒。注意：消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果；在工作台面消毒时，切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。II.培养室和超净台的消毒进入无菌培养室原则上必须彻底洗手并按外科手术要求着装，无菌服、帽子和口罩每次实验后都要清洗消毒；开始操作前要用75%酒精或0.2%新洁尔灭消毒手或前臂；如果实验过程中触及可能污染的物品或出入培养室都要重新用消毒液洗手。平时仅做观察不做培养操作时，可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服。III.洗手与着装无菌培养操作的重点：细胞培养应在超净工作台里进行，一切操作都应在火焰近处经烧灼进行；尽量避免使用先前已打开消毒包装的物品；培养用液或其他消毒后物品不应在工作区以外打开；培养液开放操作时，应避免衣袖或其他非无菌物品的细菌掉落到培养液中；在超净工作台中，应每次进行一种细胞系的操作，不同的细胞系应使用各自单独的培养液，以避免细胞系的交叉污染；超净工作台在实验完毕后，应尽可能的减少物品堆放，并用适当的消毒液擦洗台面；培养箱定期进行消毒处理；在培养过程中进行细胞的常规检查监测。IV.无菌培养操作*I.组织块原代培养法概述该方法是将从动物机体取出的组织剪切成小块后，接种于培养瓶，并使组织小块在培养液中黏附、生长，并从组织小块中游离出细胞的技术过程。组织块培养法是一种简便易行且成功率较高的常用原代培养方法。技术特点操纵简单、适合于组织量少的原代培养反复剪切和接种的过程对组织块存在损伤，有的组织小块不能长出细胞。技术步骤与注意事项组织块原代培养的注意事项取材时要严格无菌操作，组织样本要尽量避免紫外线照射和接触消毒用化学试剂。取材组织时，应细心除去组织上带有的血液、脂肪、神经组织、结缔组织和坏死组织，在修剪和切碎过程中，为避免组织干燥，可浸泡于少量培养液中；组织块接种后1~3天，由于游出细胞数少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动过程中要注意动作轻巧，尽量不要引起液体的振荡而产生对组织块的冲击力使其飘起；在原代培养1~2天内要特别注意观察是否有细菌、霉菌的污染，一旦发现，要及时清除，以防给培养箱内的其他细胞带来污染；原代培养3~5天，需换培养液一次，去除漂浮的组织块和残留的血细胞；原代培养过程中，应采用丰富的培养液，最好添加10%~20%的FCS；如组织块不易贴壁，可预先在瓶底涂薄层血清、胶原或胆汁等。组织消化法原代培养的技术步骤30~50倍体积的0.25%胰蛋白酶，37℃消化20~60min过100目孔径的细胞筛除掉未充分消化的大块组织和成分800~1000rpm离心去除胰蛋白酶，用平衡盐溶液或培养液漂洗1~2次加入培养用液制成细胞悬液细胞计数，一般按照

接种培养瓶

组织消化法原代培养的注意事项取材与修剪组织的操作的注意点与“组织块原代培养”相同；胰蛋白酶的消化效果主要与pH、温度、胰蛋白酶的浓度、组织块的大小和硬度有关，因此要根据具体情况调整消化液浓度和消化条件；胰蛋白酶消化后，可直接加入含血清的培养液终止消化；而胰蛋白酶与EDTA的混合消化液则必须离心才能除去EDTA；其他的酶如胶原酶、链霉蛋白酶、黏蛋白酶、蜗牛酶等也可用于组织消化，需根据酶的作用特点及组织成分的不同选择使用；对于一些纤维成分很少的组织，如脑组织、部分胚胎组织和一些肿瘤组织，可采用机械法制备细胞悬液；对悬浮生长的细胞，如白血病细胞、骨髓细胞和腹水瘤细胞等可不经过消化直接离心分离收集；同样要注意细胞生长的常规监测。第二节

原代培养与传代培养技术2.传代培养技术当原代培养成功后，细胞分裂增殖扩展成片，占满培养器皿的表面，这时需要进行分离培养。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称为传代；进行一次分离再培养称为传一代。根据细胞生长类型的不同，传代培养技术也可以分为两类I.贴壁生长细胞的传代培养II.悬浮生长细胞的传代培养I.贴壁生长细胞的传代培养贴壁生长细胞的传代培养使用消化法传代。技术步骤S1:吸除或倒掉培养器皿内旧的培养液S2:加入适量消化液S3:37℃或室温环境下消化2~5min后，显微镜下观察，若发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即终止消化S4:加入含血清培养液（只有胰蛋白酶）或离心漂洗（含有EDTA），终止消化S5:用弯头吸管吸取器皿内培养液，反复吹打瓶壁细胞，制备细胞悬液S6:细胞计数，并接种于新的培养器皿内II.悬浮生长细胞的传代培养悬浮细胞转代是不必采用酶消化方法，而可离心收集细胞后传代。技术步骤S1:将细胞连同培养液一并转到离心管内，800~1000rpm，离心5min，弃上清S2:加入新鲜的培养液到离心管内，用吸管吹打，制备细胞悬液S3:细胞计数，并接种于新的培养器皿内，置于CO2培养箱培养有时也可直接传代，即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。第三节

贴壁培养与悬浮培养技术2.悬浮培养技术[定义]是指细胞自由地悬浮于培养液内生长繁殖的一种培养方法。[适用范围]一切非贴壁依赖性细胞或兼性贴壁细胞，例如杂交瘤细胞和小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0，NSO），对于部分适于贴壁培养的细胞（如CHO和BHK细胞）可通过细胞生长形式的驯化，使其适应于悬浮培养。[优点]细胞传代时无需消化，避免了操作对细胞的损害；细胞收率高；操作简便、工艺可控性强、培养条件均一、易于放大培养规模。[缺点]细胞培养体积较大，相对细胞密度低，设备资金投入大；适用面窄；不适于包括二倍体细胞在内的正常组织细胞培养，具有转化致癌的可能；第四节

动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养技术和悬浮培养技术基础上发展起来的，主要包括以下几种常用技术：1.动物细胞的深层悬浮培养技术2.微载体培养技术3.微囊化培养技术4.中空纤维法培养2.微载体培养技术1967年，凡-维茨尔开发了微载体系统培养贴壁细胞，在一定程度上解决了“贴壁培养难于放大的技术障碍”。微载体是直径为60~250微米的微珠，最初使用的材料是用一种离子交换树脂（DEAE-SephadexA-50）做基质，后经改进，用带不同基团的葡聚糖交联成几种大分子，使其带有适当电荷，以利于细胞的贴壁及生长。表面积与体积之比（S/V）大，因此它的单位体积培养基的细胞产率高，培养基利用率高，若提高微载体浓度，细胞产率会更大。劳动强度小、培养系统占有空间小、生产规模放大容易。把悬浮培养和贴壁培养融合在一起，具有两种培养优点。用简便的显微镜观察即能监测出细胞在微珠生长情况。收获细胞及胞外产物的过程不复杂。微载体培养技术培养细胞的技术步骤S1:选择合适的微载体类型（通过计算不同微载体的细胞贴壁率和细胞数，比较细胞容纳量，微载体用量和搅拌速度）S2:微载体的浸泡水化及消毒（无钙和镁的PBS浸泡、洗涤和消毒；使用时微载体浓度一般为3mg/100ml，搅拌速度为50~70r/min）S3:细胞接种（根据细胞类型决定接种浓度）S4:培养观察与计数（直接镜下观察细胞在载体表面的生长情况，并用胰蛋白酶消化后，测每毫升培养体系中的细胞数）S5:消化（收集培养体系，洗去已酸化的培养液，用50~100ml/g微载体的消化液消化，按20~30ml/g微载体的比例加入血清终止消化）S6:分离细胞（分组沉降、400rpm低速离心或100微米筛网过滤）S7:传代培养（若需进一步传代以放大培养，可向脱离微载体的细胞加入新的微载体）用于动物细胞培养的微载体的定义和种类微载体是指直径在60~250微米、适用于细胞贴壁生长的固体或半固体实心微球，以及不仅适用于贴壁依赖型细胞也可用于非贴壁依赖型细胞的固定化培养的内部具有完全连通沟回的多孔微载体。随着微载体培养技术的不断发展，商品化的微载体的种类越来越多，按其机制材料可以划分为：交联葡聚糖微载体塑料微载体明胶/变性胶原微载体玻璃微载体纤维素微载体理想的微载体所应具有的特征生物相容性好简便的无毒害固定化过程良好的传质特性良好的机械稳定性最大的比表面积适合细胞生长的形状和大小粒径分布均一能高压灭菌可重复利用，易于清洗能保护细胞免受机械损伤接种方便能固定大部分细胞适合大规模培养易使细胞、载体和培养基分离适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养3.微囊化培养技术微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可以自由透过，而各种酶和蛋白质等大分子物质可包裹在其中不能溢出，利用它们催化反应底物。微囊化培养技术的定义与优点是借鉴固定化技术将细胞包裹在微囊中，在培养液中悬浮培养；细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护，细胞总的生长体积有一定的增加，而且减少了搅拌对细胞产生的剪切力；由于环境的改善，细胞会很好的生长，细胞密度和纯度提高；是一种利于生产分泌型胞外产物（如单抗）的大规模细胞培养技术；不仅适合于非贴壁依赖型细胞的大规模培养，同时也适合贴壁依赖型细胞；微囊化培养的细胞还能作为治疗性人工器官或肿瘤药物的体内筛选。微囊化细胞的模式图自本世纪60年代固定化酶技术问世以来，用微囊化方法包埋生物大分子及细胞的方法很多，但并不是所有的方法都能适合于动物细胞的，它必须具备以下一些条件：微囊化的过程要温和，快速，不损伤细胞，尽可能在液体状态和生理条件下制备；微囊化所用的试剂和膜材料必须对细胞无毒害作用；微囊化所形成的膜必须能使营养物和代谢产物自由通过，膜的孔径可以控制；膜应具有足够的机械强度以抵抗培养过程中的搅拌，不至使微囊破裂；微囊的大小应当适中，直径一般控制在200~400微米范围。总观目前的方法用得最多的是海藻酸-聚赖氨酸（ALG-PLL）包埋法。动物细胞微囊化需具备的条件动物细胞微囊化的技术步骤（ALG-PLL法）S1:将分离好的细胞悬浮在1%~1.2%的海藻酸钠溶液中（保证与细胞等渗及等生理pH），细胞终浓度达到1×107cell/ml。S2:细胞悬浮液经微囊发生器制成微粒微球，将微球加入1.3%CaCl2溶液后制成凝胶球，10min后，去除上清收集胶球，并用生理盐水缓冲液清洗S3:加入0.05%的聚赖氨酸，微球胶体颗粒表面包裹一层膜形成微囊，用生理盐水缓冲液洗两次S4:将微囊悬浮于0.06%的海藻酸钠溶液中反应5min，用生理盐水缓冲液漂洗S5:用1.5%的柠檬酸钠处理8~10min，重复处理一次，用生理盐水缓冲液洗涤3次S6:将含有细胞的微囊放入培养液中培养PS：通过控制赖氨酸的浓度、与海藻酸钠球混合的时间、溶液的pH和温度等条件，能够制备孔径大小不同的微囊化细胞。4.中空纤维细胞培养技术中空纤维细胞培养技术的产生中空纤维培养技术是理查德-克瑞克等在1972年发明的，最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。这样，水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也能在上面贴附生长。目前已开发出由硅胶、聚砜、聚丙烯等材料构建的空心纤维培养系统中空纤维细胞培养技术的原理模拟机体内组织器官的供血系统，利用具有通透性的中空纤维或称毛细管作为维持细胞正常代谢的物质通道而建立的一种动物细胞体外大规模培养方法；中空纤维切面电镜图谱中空纤维细胞培养技术的原理中空纤维细胞培养技术的优点由于中空纤维能够给外腔细胞提高营养清除代谢物，因此能够十分方便的分离和纯化培养细胞分泌的产品，在生产激素和单抗时经常采用。中空纤维培养技术无机械剪切，物质传递效率高，能有效提高细胞和产物水平。中空纤维细胞培养技术的局限性中空纤维反应器中营养物质沿流向的梯度衰减；（加大流速，缩短长度）靠近膜的部位的细胞得以优势生长，当细胞长到一定的密度时，细胞富集在膜表面，往往造成膜孔堵塞，远离膜的细胞得不到足够的营养物质和氧而生长缓慢或死亡；（采用双腔中空纤维反应器）在使用过程中，大分子易堵塞膜，中空纤维反应器不能重复使用。第五节

动物细胞体外培养的操作方式无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，就操作方式而言，动物细胞的深层培养可分为下列5种操作方式：1.分批式（Batch）2.流加式（Fed-Batch）3.半连续式（Semi-continuous）4.连续式（Continuous）5.灌注式（Perfusion）不同的操作方式，具有不同的特征。1.分批式培养基本概念分批式培养是指将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间反应后，将整个反应系取出的细胞培养操作方式。细胞生长情况细胞生长分为四个期：延迟期、生长期、稳定期和衰退期特点分批式操作，操作简便，容易掌握，是常用的操作方式。细胞所处的环境时刻都在发生变化，不能使细胞自始至终处于最优条件下，并不是一种好的操作方式。2.流加式培养基本概念流加式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成。随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步生长代谢，到反应终止时取出整个反应系；从控制角度可分为无反馈控制流加和有反馈控制流加两种；最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、维生素和其他细胞生长所需物质。特点

流加培养可以根据细胞生长速率、营养物消耗和代谢产物抑制情况，流加营养培养液。一方面，它可以避免某种营养成分的初始浓度过高而出现底物抑制现象，另一方面，能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成；由于新鲜培养液的加入，整个过程中反应体积是变化的，因此常使用浓缩培养液；根据不同情况，存在不同的流加方式无反馈控制流加包括定流量流加和间断流加等。有反馈控制流加，一般是连续或间断地测定系统中限制性营养物质的浓度，并以此为控制指标，来调节流加速率或流加液中营养物质的浓度等。3.半连续式培养基本概念半连续式培养又称为反复分批式培养或换液培养，是指在分批式操作的基础上，不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批式操作的方式进行培养，反应器内培养液的总体积保持不变的操作方式。特点培养物体积逐步增加；可进行多次收获；细胞可持续对数生长；培养可延续很长时间。这种操作方式可以反复收获培养液，对于培养基因工程动物细胞分泌有用产物或病毒培养过程比较实用，尤其是微载体培养系统更是如此。例如，采用微载体系统培养基因工程rCHO细胞，待细胞长满微载体后，可反复收获细胞分泌的乙肝表面抗原（HBsAg）制备乙肝疫苗。4.连续式培养基本概念连续式培养，是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。特点连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳定，可以使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成；可以连续不断地收获产物，并能提高细胞密度，在生产中被应用于培养非贴壁依赖性细胞。如英国Celltech公司采用连续培养杂交瘤细胞的方法，连续不断地大量生产单克隆抗体。对于细胞的生理或代谢规律的研究，连续培养是一种重要的手段。5.灌注培养基本概念灌注式操作是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器，一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。特点灌注培养方式的细胞截流系统可使细胞保留在反应器内，维持较高的细胞浓度，一般可达107~108个／m1，从而提高了产品的产量;连续灌注系统,使细胞稳定的处于较好的营养环境中,有害代谢废物浓度积累较低;反应速率容易控制,培养周期较长,可提高生产率,目标产品的回收率高;产品在罐内停留时间短,可及时回收并在低温下保存,有利于保持产品的活性;在病毒、单克隆抗体等胞外生物活性生物制品的大规模产生中，灌注培养可以不断地收获产物，特别是采用无血清/无蛋白培养基时，能够将生产和分离在线偶联。第六节

动物细胞生物反应器大规模培养技术由于动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切敏感以及对体外培养环境有严格的要求，传统的微生物发酵反应器不适用于动物细胞的大量培养，因而对动物细胞培养用反应器的设计和过程控制提出了特殊的要求。1.动物细胞培养生物反应器应具备的基本要求2.几种新型生物反应器3.动物细胞体外放大培养的主要阶段4.生物反应器动物细胞大规模培养的关键技术5.动物细胞生物反应器大规模培养的应用1.动物细胞培养生物反应器应具备的基本要求一台生物反应器的设计必须具备如下的6个基本要求：生物因素：生物反应器必须有很好的生物相容性，反应器内空间利用率高，具有合适细胞生长的载体系统和材料。化学因素：设计必须提供足够的停留时间，完成所需要的转化度，符合过程反应动力学的要求。传质因素：混合系统设计应能提供均匀、温和的混合培养状态剪切力小，保证良好的传质效果。传热因素：能够精确地控制温度。安全因素：有毒害的反应物和产物的隔离，能够严格地保证无污染环境。操作因素：能够方便、快捷地实现培养液的连续添加、样品的采样和观察；能够精确地控制酸碱度、溶解氧和CO2浓度等工艺条件。

2.几种新型生物反应器常见的动物细胞培养用生物反应器有：气升式生物反应器搅拌式生物反应器中空纤维生物反应器A.气升式生物反应器[工作原理]

气体混合物从底部的气体分布器进入反应器的导流管，使导流管内的流体密度低于其他区域，从而形成循环。动物细胞培养一般采用内循环式。[特点]

器内无机械运动部件，由剪切力导致的细胞损伤率比较小；氧传递速率高；液体循环量达，传质性好；通气产生的气泡对细胞有损伤。[应用]

悬浮细胞（如杂交瘤）的培养。[设计要求]

底物的气体分布器为环形管，孔的设计要保证在控制的气速范围内产生的气泡直径为1~200mm，空气流速一般控制在0.01~0.06L/min，反应器的高径比一般为3:1~12:1。B.搅拌式生物反应器[工作原理]

利用机械搅拌产生反应器内流体的循环混合。[特点]

参数的放大和过程控制，比其他培养系统容易理解和掌握。[应用]

该类生物反应器是动物细胞培养生产工艺中使用最多的一种，特别是重组治疗性蛋白和抗体的规模化生产；还可用于固定化细胞的培养。[设计要求]

搅拌器转动时产生的剪切力小，混合性能好；深层通气而不产生泡沫C.中空纤维生物反应器[工作原理]

把细胞限制在具有半透膜性质的中空纤维外壁生长，培养液从中空纤维管中流过，细胞通过半透膜获得营养物质和氧。[应用]应用广泛，特别是胞外产物的大规模生产。[特点]

易操作、稳定；中空纤维的过滤功能有利于培养过程的营养控制、细胞的生长和产物的回收；通过两个或多个的反应器组合，可实现反应与分离的耦合。[设计要求]

营养物质沿流向的梯度衰减会造成管式中空纤维反应器的细胞分布不均匀，限制培养系统的进一步放大。3.动物细胞放大培养的主要阶段所谓大规模培养的“大”就是指细胞培养的放大大，通常是指生产规模的增大和生产能力的增加。动物细胞培养由实验室建立的细胞株到反应器的大规模培养一般经历5个不同的阶段：第一阶段是筛选和开发能表达所需产物的细胞系。这一阶段通常涉及到重组DNA技术和细胞融合技术以期获得一个有较高生长速率、较强的抗诱变性能、很高的专一表达水平和生产速率的细胞株。第二阶段是在方瓶或转瓶中确定该细胞系对营养物质和环境的要求。第三阶段是将细胞培养转入生物反应器中进行，最理想的是采用由生产规模的反应器缩小的台式反应器，通常为15L。对细胞的营养物质要求和环境条件参数要进行验证和修正，确定最佳的操作方式（如分批、流加、半连续、连续或灌注操作）。放大的过程从这一阶段开始。第四阶段在中试规模进一步根据生产的实际条件和可能性，确定过程的控制方案，根据细胞株的实际情况寻求过程的优化方案，对培养的环境作进一步的调整。这一阶段是把实验室的结果引向生产水平过程中所必需的，其中包含有许多在转入生产规模时所必须解决的工程问题。第五阶段是扩大到生产规模，所用的反应器是生产规模的，但是还必须与中试过程密切结合，在生产规模中尚需解决的问题可以和中试车间的试验相结合，以最终实现由实验室研究转入工业规模的生产。4.生物反应器动物细胞大规模培养的关键技术动物细胞的放大培养受到很多因素的限制，因此在动物细胞的大规模培养时应重点注意：培养基细胞系细胞培养环境细胞的死亡与调亡污染控制培养的过程控制A.培养基动物细胞培养基是细胞赖以生长、繁殖、分化的重要因素，也是影响动物细胞大规模培养的关键要素。无血清培养基的应用和开发是当前细胞培养领域的一大课题。无血清培养基能避免血清的批次、质量、成分等对细胞大规模培养造成的污染、毒性作用和质量不稳定等不良的影响；在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养，同时产出的产物容易回收；但无血清培养基不适用于广泛的细胞类型，需要条件摸索。B.细胞系稳定、高产、安全的细胞系是决定动物细胞大规模培养的根本要素。通过建立原始细胞库、主细胞库和生产细胞库三级细胞库系统以及相关的细胞背景资料及核准手续，保证大规模生产的稳定、高产、高质和安全；通过生物技术方法建立能够高效表达外源基因并正确加工表达产物的基因工程细胞系，能够提高整个表达系统的产率；通过生物技术方法改变细胞代谢途径，从而使细胞能够在无血清（甚至是无蛋白）的培养基中大规模培养和生产。C.细胞培养环境大规模动物细胞培养中，由于大量细胞的代谢，细胞环境发生改变，许多限制性因素的产生和积累都会限制细胞的放大培养的生产。常见的限制性因素有：氨离子（氨离子的积累会影响细胞生长和蛋白的糖基化过程）乳酸（糖代谢产物，乳酸的积累会抑制能量的产生，影响细胞生长）CO2（CO2

的积聚，会对细胞产生毒性，改变细胞的代谢水平，影响pH）甲基乙二醛（脂类和氨基酸代谢的产物，对细胞有潜在损伤）渗透压（高渗透压能提高目的蛋白的表达水平，加入渗透压保护剂稳定细胞）可利用的生长表面积（微载体、多孔载体）上述培养环境中的限制性因素不仅可以通过培养基组成来调节，同时操作方式的改变（连续、灌注）等过程的调控确能起到十分好的效果。D.细胞的死亡和调亡大规模动物细胞培养的后期，维持细胞高的活力是富有挑战性的课题。最初认为此时的细胞死亡大多由于坏死，而逐渐认识到一些细胞系在生物反应器中死亡主要原因是细胞凋亡，目前认为细胞凋亡的发生是大规模细胞培养过程的重要制约环节，预防并控制细胞凋亡也就成为了研究热点：用基因工程方法将细胞凋亡抑制基因（如bcl-2基因）导入细胞；由于细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生，因此可以通过培养操作方式的改变，使细胞达到生长平衡态。E.污染的控制动物细胞培养物可能被各种微生物病毒污染。这些污染物的来源包括细胞种子、血清、试剂、实验室环境和操作人员。污染的控制起始于细胞种子及其保存。对冻存细胞必须严格测试证明其无污染。某些组分如血清或胰酶（用在贴壁生长细胞的传代培养）可能被支原体或病毒污染。有些污染物难以被过滤除菌除去，故可高温灭菌的培养基应运而生。实验室或中试车间需要有快速、灵敏和价廉的测试方法检定支原体和病毒等常见的细胞培养污染物。在生产过程或实验室空间中，完全没有微生物的污染是不可能的，这需通过改进设备的设计消除这些污染源，其中反应器的设计是关键。实验人员也常是重要的污染源，无菌操作技术的良好训练是污染控制的基础。F.培养的过程控制大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢，细胞培养环境迅速改变，过程在线监控非常重要。在线测定生物反应器中培养条件、代谢产物和目的产物浓度等大量数据，并对测定结果进行分析处理，及时对培养系统进行反馈性控制是成功进行大规模动物细胞培养的需要细胞培养环境的监控（温度、pH、溶氧、渗透压、CO2）产物浓度的在线监控（在线取样与层析技术偶联，蛋白含量和性质鉴定）5.动物细胞生物反应器大规模培养的应用利用生物反应器大规模培养动物细胞生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等已成为生物医药高技术产业的重要部分：目前动物细胞生物反应器培养生产的生物制品主要有以下几类：病毒疫苗（乙肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗、狂犬疫苗）非抗体免疫调节剂（干扰素、白细胞介素、B细胞生长因子、巨噬细胞激活因子等）多肽生长因子（神经生长因子、成纤维生长因子、表皮生长因子、血清生长因子等）酶类（组织纤溶酶原激活剂等）激素（红细胞生成素、促黄体生成素、促滤胞素等）肿瘤特异性抗原（癌胚抗原、甲胎抗原等）单克隆抗体病毒杀虫剂（杆状病毒等）1996年至1997年使用哺乳动物细胞系生产的获得

许可的诊断用重组生物制品（BLA）产品BLA名称生产商批准日期产品类型细胞系方法培养基人I，II型T淋巴病毒／AbbottHTLV-1/HTLV-2EIATM（用于酶免疫分析）AbbottLaboratories8/15/1997鼠单克隆抗体，鼠／人IgG1慢性感染的人T和B淋巴细胞未公开未公开Capromabpendtide/ProstaScintTM（癌症造影剂）Cytogen10/28/1996单克隆抗体（mAb）鼠杂交细胞系中空纤维无血清，含牛血清白蛋白和转铁蛋白Nofetumomab/VerlumaTM（癌症造影剂）DrKarlThomae8/20/1996单克隆抗体（mAb），鼠抗IgG1哺乳动物细胞未公开无血清Imciromabpentetate/MyoscintTM（心脏造影剂）Centocor7/3/1996单克隆抗体（mAb），鼠抗IgG2bFab片段鼠杂交瘤细胞系未公开含血清，含庆大霉素1997年至1998年使用哺乳动物细胞系生产的获得

许可的疫苗及细胞用重组生物制品（BLA）产品BLA名称生产商批准日期产品类型细胞系方法培养基Rotavirus疫苗（狂犬病疫苗）WyethLaboratories8/31/1998活病毒疫苗FRh1-2未公开培养基中含胎牛血清，新霉素硫酸盐和两性霉素Rabavert用于狂犬病的免疫ChironBehring10/20/1997疫苗未公开未公开未公开甲肝疫苗灭活／VaQTATM（用于预防甲型肝炎）Merck&Co3/29/1996灭活病毒人MRC－5二倍体细胞贴壁，NCF到Costar培养管，连续补料培养含血清自体培养软骨细胞／CarticelSMServicesTM（修复软骨性缺陷）Genzymetissue8/22/1997自体同源细胞软骨细胞组织培养瓶含血清1998年至1999年使用哺乳动物细胞系生产的获得

许可的治疗用重组生物制品（BLA）产品BLA名称生产商批准日期产品类型细胞系方法培养基－n1干扰素lymphoblastoid/WellferonTM（治疗慢性丙型肝炎）WellcomeFoundationLiminted,3/25/1999内源糖蛋白人淋巴细胞未公开未公开血凝因子VIIa（重组）／NovoSevenTM（用于治疗A型和B型血友病）NovoNordiskA/S3/25/1999重组糖蛋白BHK未公开含新生牛血清Etanercept/EnbrelTM（治疗风湿性关节炎）Immunex11／2／1998IgG1与TNF受体融合CHO搅拌釜式反应器，悬浮未公开Trastuzmmab/HerceptinTM（治疗转移性乳腺癌）Genentech9/25/1998单克隆抗体（mAb)带有鼠CDRs的人源化IgG1CHO搅拌釜式反应器，悬浮无血清，含庆大霉素Infliximab/RemicadeTM（治疗局部性回肠炎）Centocor8/24/1998单克隆抗体（mAb),鼠／人嵌合抗体IgG1鼠杂交瘤细胞系重组NSO搅拌釜反应器，悬浮，灌流培养（旋转过滤器）无血清，含蛋白水解物，牛转铁蛋白，胰岛素，血清白蛋白和ExcyteTM1996年至1998年使用哺乳动物细胞系生产的获得

许可的治疗用重组生物制品（BLA）产品BLA名称生产商批准日期产品类型细胞系方法培养基Palivizumab/SynagisTM（预防呼吸性融合细胞病毒）Medimmune6/19/1998单克隆抗体（mAb）鼠杂交瘤细胞系重组NSO搅拌釜反应器，悬浮，补料培养无血清Basiliximab／SimulecTM（预防急性器官排斥反应）NovartisPharmacerticals5/12/1998单克隆抗体（mAb),鼠／人IgG1鼠杂交瘤细胞系重组NSO搅拌反应器，悬浮，灌流培养无血清Daclizumab/ZenapaxTM（预防急性器官排斥反应）Hoffman-La-Roche12/10/1997单克隆抗体（mAb),鼠／人IgG1SP2/0未公开未公开Rituximab/RituxanTM（治疗B细胞非Hodgkin淋巴瘤病）IDEC-Pharmacertical/Genentech11/26/1997单克隆抗体（mAb),鼠／人IgG1CHO搅拌釜反应器，悬浮含庆大霉素血凝因子IX（重组）／BenefixTM（控制B型血友病人的出血发生率）GeneticsInstitute2/11/1997重组糖蛋白CHO搅拌釜反应器，悬浮，批式补料培养无血清，含重组胰岛素干扰素－1a／AvonexTM（用于多发性硬化的治疗）Biogen5/17/1996重组糖蛋白CHO搅拌反应器，悬浮未公开2000年使用哺乳动物细胞系生产的获得

许可的诊断用重组生物制品（BLA）产品BLA名称生产商批准日期产品类型细胞系方法培养基IDMicroTypingSystem（Anti-A）MicroTypingSystem，Inc09/21/2000鼠单克隆抗体BIRMA-1细胞系未公开未公开IDMicroTypingSystem（Anti-B）MicroTypingSystem，Inc09/21/2000鼠单克隆抗体LB-2细胞系未公开未公开IDMicroTypingSystem（Anti-AandAnti-B）MicroTypingSystem，Inc09/21/2000鼠单克隆抗体ES－15＆细胞系未公开未公开IDMicroTypingSystem（Anti-D）MicroTypingSystem，Inc09/21/2000人单克隆抗体MS201细胞系未公开未公开2000年至2002年使用哺乳动物细胞系生产的获得

许可的生物制品（BLA）产品BLA名称生产商批准日期产品类型细胞系方法培养基Rebif（降低回归热性硬结病人临床病情恶化）Serono3/7/2002干扰素－1aCHOAranesp（治疗慢性肾衰相关的贫血）Amege9/17/2001TWINRIX（甲肝灭活和重组乙肝疫苗）SMITHKLINEBeechamBiologicals5/11/2001MRC-5生产甲肝疫苗，酵母生产乙肝疫苗Campath（治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病）MillenniumandILEXPartnersLP5/7/2001CHO悬浮培养含neomycinTenecteplase/TNKaseTM（降低急性心肌梗塞死亡率）Genentech6/2/2000重组糖蛋白CHO未公开未公开抗血友病因子（重组）／ReFactoTM（控制血友病发生率）GeneticsInstitute3/6/2000重组糖蛋白CHO连续灌流无血清，含有人血清白蛋白和重组胰岛素第七节

细胞培养中污染的检测与排除污染是细胞培养工作的大敌。在工作中，除需要好的实验设计和技术方法外，成败的关键还在于能否避免污染。一项好的研究，或获得的满意细胞株，往往由于遭受污染而前功尽弃。因此，在细胞培养工作中，要始终注意防止和控制污染

。凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都应视为污染。微生物：真菌、细菌、支原体和病毒[最易发生、最难防止]化学物质（毒性物质）：影响细胞生存的、非细胞所需的化学成分

[少发生、易防止]

其他细胞：非同种的其它细胞

[容易防止]一、细胞培养中污染的来源和途径1.空气空气是微生物转播的最主要途径。由于空气流动性大，在操作空间与外界隔离不严和消毒不充分的情况下，外界不洁空气很容易侵入造成污染。因此培养设施不能设在通风场所；现各实验室普遍使用净化工作台，能产生滤过的无菌的屏障气流，可有效防止不洁空气的侵入。但净化工作台使用过久、滤器受尘埃堵塞，可是净化工作不能正常进行。因此要定期检查和清洗高效滤器。工作时不带口罩或面对操作野大声讲话、咳嗽等使外界气流过强，污染空气均可进入操作野，造成污染。因此，工作时减少空气流动是防止污染的重要环节；虽然采用多种措施，但也难以排除空气中所有微生物。操作野每立方米内含菌数不应超过15个。2.培养用品各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底；污物残留及培养用液等灭菌不彻底，都可以引入有害物质；另外需要主要的是CO2培养箱，由于箱内湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌滋生，而CO2培养箱内是开放式培养，如不定期消毒，可形成污染。3.操作过程实验操作无菌观念不强、动作不准确、使用污染的器具，或封瓶不严，都可发生污染；培养两种以上细胞时，操作不规范，交叉使用吸管或培养液瓶等有可能导致细胞交叉污染；因此，所有工作要进行得有条不紊和安全可靠，操作时由始至终要保持一定顺序性，动作要准确敏捷，并要注意防止空气流动，减少污染机会，培养器具如吸管等应分别使用，不能混用

，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。4.血清血清也是污染的主要来源，市售血清有的制备不严、检测不严，常已被支原体或病毒等污染。因此，要购买可靠厂家的血清，并最好先进行检测后再用。5.组织原代培养的污染多数来源于组织样本；另外，手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的碘也可以影响细胞的生长；因此，手术时一定要严格消毒，规范操作，避免组织或细胞污染。二、污染对细胞的影响当细胞受到有害物污染时，轻者细胞增殖生长缓慢、分裂相减少，细胞粗糙，轮廓增强，胞质出现较多的颗粒状物质；污染较重的细胞增殖停止、分裂相消失、细胞质出现大量的堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。支原体污染细胞后，培养液不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细胞变化也可由于传代、换液而缓解，因此容易被忽视。但个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。不同的污染物对细胞的影响也不同。支原体和病毒对细胞形态和机能的影响是长期的、缓慢的和潜在的；霉菌和细菌繁殖迅速，在很短时间内压制细胞生长或产生有毒物质杀灭细胞；化学物质污染如重金属或其它化学试剂混入培养液中后，有的毒性小，如能及时排出细胞仍可存活，但有些烃化物如多环芳烃等有致突变性，能导致细胞发生转化。三、微生物污染的检测1.真菌污染的检测2.细菌污染的检测3.支原体污染的检测1.真菌污染的检测在微生物污染中，以真菌污染最多，最常见的有：烟曲霉、黑曲霉、毛霉、孢子霉、白色念珠菌、酵母菌等。真菌种类繁多，形态各异，但污染后均不难发现，霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色小点漂浮物，一般肉眼可见，较易发现，短期内培养液多不浑浊；倒置显微镜下可见在细胞之间有纵横交错穿行的呈丝状、管状或树枝状的菌丝，并悬浮漂荡在培养液中。念珠菌和酵母菌形态呈卵圆形态，散在于细胞周边和细胞之间生长。2.细菌污染的检测细菌污染较为多见的是以白色葡萄菌、大肠杆菌、假单孢菌、枯草杆菌等。加用抗生素的培养液一般可预防和排除个别少量细菌的污染。一旦发生细菌污染很容易发现：多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生；同时培养液变混浊，有时静置的培养液初看不浑浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂浮；倒置显微镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并出现中毒表现；必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染的，可取出少量培养液向肉汤培养及内滴加，37℃下培养可以检测是否污染。3.支原体污染的检测支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉、最干扰实验结果的一种污染。近年随实验设备的改善和技术方法的改进，支原体污染率有所下降，但未能彻底杜绝

，污染仍时有发生。支原体污染是细胞培养研究室重点预防对象支原体是一种大小介于细菌和病毒之间（直径为0.2~2微米）、并独立生活的微生物，约有1%可通过过滤菌器。支原体无细胞壁，形态呈高度多样性，有圆形、丝状或梨状等，在光学显微镜下不易看到内部结构。多数支原体适于偏碱条件下生存（pH7.6~8.0），对酸耐受性差，对热较敏感，对一般抗生素不敏感。支原体多吸附或散在分布于细胞表面和细胞之间，能抑制细胞代谢和生长，能影响DNA合成，引起一系列严重后果，如改变细胞染色体核型、增加染色体畸变等。细胞培养中的绝大部分来源于人和牛，其次是猪。3.支原体污染的检测支原体污染细胞后，培养基不发生浑浊、细胞病理变化轻微或不明显，所以难以发现。为确切证明是否有支原体污染，有以下一些检测方法：相差显微镜检测低渗溶胀处理地衣红染色观察法DNA荧光染色法电镜检查支原体培养法相差显微镜检测将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，使细胞面向上置于载物台上，再盖上一较大盖片（也可取少许培养液滴于载玻片上，再盖上盖玻片），用相差油镜观察。支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面或细胞之间，有类似布朗运动的表现。相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。

该法为固定染色法，通过对细胞低渗处理，使细胞体积扩张，细胞膜表面的皱褶和结构减少，使附着在细胞表面的支原体容易被识别。该法简便易行，标本可长期保存，亦可用于检测真菌和细菌。操作步骤如下：S1取材：用盖玻片培养法或培养液均可。用培养液时，先吸取培养液1ml，500~800rpm离心5min后，弃去上清，余0.2ml备用。S2低渗处理：用新鲜配制的0.5%的枸橼酸溶液，处理盖玻片上的细胞或加入到步骤一获得的0.2ml悬液中，置10min。S3固定：用新鲜配制的Carnoy液固定2次，共10min，取出盖玻片晾干；而培养液，则先离心弃上清固定液，余沉淀物0.2ml，制成涂片2~3片。S4染色：用2%醋酸地衣红染色5min。S5封片：树胶。S6观察：支原体细胞被染成紫红色，支原体附着于细胞表面或散在细胞之间。低渗溶胀处理地衣红染色观察法DNA荧光染色法该法用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechast33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。具体方法如下：S1取材：将细胞接种盖玻片上，在细胞为长满前取出玻片，用不含酚红的Hank’s液漂洗一下；S2固定：用固定液（1:3的醋酸甲醇溶液）固定10min，然后用生理盐水漂洗；S3染色：将上步漂好的样品置于用生理