牧草及饲料作物育种学

牧草及饲料作物育种学实验指导米福贵云锦凤内蒙古农业大学2001年5月

目录TOC\h\z\t"实验几,1"实验一牧草及饲料作物育种田间试验计划书的拟定 1实验二多年生牧草越冬率测定 4实验三无性系的建立 6实验四牧草开花习性的观察方法 8实验五花粉生活力测定 12实验六花粉萌发试验 16实验七禾草的有性杂交技术 19实验八豆科牧草的有性杂交技术 22实验九饲用玉米自交杂交技术 24实验十植物根尖细胞压片法 26实验十一植物染色体核型分析 33实验十二植物染色体（Giemsa）分带技术 40实验十三培养基母液配制 48实验十四培养基的配制 53实验十五花药（粉）培养 56实验十六植物茎段培养 58实习十七秋水仙素引变多倍体的技术及其多倍体鉴定的方法 61实验十八辐射诱变技术 64实验十九化学诱变技术 67实验二十品种纯度的田间鉴定 71实习二十一苜蓿和禾草的育性鉴定 73实验二十二禾本科牧草的田间选择和室内考种 75附录一实验室守则 77附录二玻璃器皿的洗涤 78附录三器物和溶液的灭菌 79附录四实验室中常用酸碱浓度和比重的关系 83附录五一些常用化合物的溶解度（20℃） 85附录六化学试剂的分级和保存 86附录七显微镜摄影程序 88附录八植物组织培养中常用培养基 90附录九一些常见牧草及饲草料作物的染色体数目 93附录十一些常用单位 98主要参考文献 100实验一牧草及饲料作物育种田间试验计划书的拟定一、实习目的使学生初步学会制定田间试验计划书的方法。二、实习说明在进行任何田间试验之前，要根据试验的题目和目的要求、结合本单位的具体条件，拟定出切实可行的试验计划书，以便试验可以按计划进行。试验计划书的内容包括试验的全部情况和全部过程的说明，即从实验的题目、目的要求直到田间管理方法，试验的收获计产为止的全部过程，要尽可能地写得具体一些，以便进行试验时有所遵循。有了实验计划，便于对试验的检查，可以保证试验的质量。三、方法步骤根据试验的题目和目的要求，按下列格式编写试验计划书。（一）试验名称：写明试验的课题，如品种比较试验。（二）试验目的写明本试验要解决什么问题，达到什么效果。如进行牧草品种比较试验的目的就在于比较评定在当地自然和栽培条件下，参加试验的品种中哪些品种的产量高而稳定，综合性状表现好，符合当地生产的要求，进而为今后在当地推广这个品种提供可靠的科学依据。（三）试验材料与处理：写明供试材料（如品比试验便是参试品种）、对照的名称、代号、材料来源等。（四）试验地的设计及田间种植图：说明本试验采用哪种设计方法，如对比法、随机区组法等，并说明小区面积（长×宽）、行距、株距、走道的宽度、渠道、畦埂、重复次数，保护行（区）的设置等，计算出用地总面积，最后绘制一张详细的田间种植图，并标明方位，以备应用。（五）试验地的基本情况及管理措施：写明试验地的地势，土壤类型和肥力、前作，整地日期、整地方法，施用基肥的种类、数量、质量、施肥方法和要求，种子的准备、播种量、播种方法、间苗、定苗，中耕除草的时间、次数，病虫害防治等。（六）田间观察记载及室内考种项目：根据试验的目的要求及牧草种类的不同，以及人力的多少，田间试验的观察记载项目也有所不同，关键是要抓住试验的主要项目，突出重点。四、田间设计的注意事项1.试验地的选择。（1）试验地的土壤要有代表性；（2）试验地段要平坦；（3）试验地肥力要均匀；（4）试验位置要恰当。2.试验地的田间规划：（1）确定小区面积小区面积通常为2×5m2或4×5m2，依下列条件而定：试验的性质和要求；试验品种的多少和每个品种的种子量；试验可利用土地面积的大小；重复次数的多少。（2）确定重复次数重复次数常为3次或4次，依下列条件而定：试验要求的准确程度：每个品种的种子量；土壤肥力的差异程度。（3）试验地内保护行及人行道的设置。一般不少于1m，重复与重复之间要设人行道、小区之间要有畦背。（4）试验地面积的计算：试验地总面积=重复次数×重复内的小区数×每小区面积+人行道和保护行的面积。同时要求计算出整个试验面积的总长度和总宽度，以便田间区划。（5）各个重复试验区及重复内各小区的排列：各重复试验区的排列决定于试验地的形状、如系长方形则每一重复试验区排列在同一条地段上；如果土壤肥力不均匀，在排列时重复的方向应与土壤肥力的差异成垂直。五、作业每个学生拟定一份完整的品种比较试验计划书（包括计划的田间种植图）。

实验二多年生牧草越冬率测定一、目的和说明多年生牧草能否在我国北方冬春气候严寒地区安全越冬，是关系到它能否在这里生存及在生产中利用的首要问题。多年生牧草越冬率测定多运用于外地引入品种，特别是从温暖地区引入寒冷地区的品种，以及一些耐寒性差的品种。越冬率测定是引种及抗寒育种鉴定的重要项目之一。本试验的目的，在于了解多年生牧草越冬性的含义及进行越冬率测定的必要性，熟悉越冬率测定的一般方法。如在牧草育种中，区别多年生牧草不同种或品种的越冬性强弱，为选出抗寒性强，越冬良好的原始材料和育成品种提供依据。这里需要说明一下，越冬性是指牧草在冬春季节对外界综合的不良条件的抵抗性；抗寒性是指牧草对低温的低抗能力。因此，越冬性和抗寒性不能混为一谈。也就是说，抗寒性好的，越冬性不一定好；而越冬不良的，也未必全是受低温的影响。因为牧草越冬不良的原因很多，除低温对植物发生危害以外，如冬季土壤干旱；长期复雪，或冬季淹水，或融雪化冰造成土壤缺氧；冬季病害以及早春地表昼消夜冻造成的机械损伤等都会引起植物死亡。因此，我们在分析越冬不良的原因时，应全面加以考虑，具体分析。一般说来，严寒是决定植物能否越冬的主要因素。但不是唯一因素。二、材料和用具鉴定材料为紫花苜蓿（或红豆草等）的原始材料圃。用具：有米尺、铅笔、记载本、小锹等。三、方法和步骤在气候温暖、湿润的地区，越冬率的测定要分两次进行，头一年入冬前要固定样方或样点、查明株数，入冬土壤结冻前，选择当年播种或上年播种的大田或试验小区，各选择确定若干个50×50cm的样方，四角钉以木椿，作好标记，查明株数。如系条播的可分别选择若干样点。每点行长1m2行，每行查明株数，每样点钉上木椿，作好标记。供测定的样方或样点，如当年刈割时，留差高度均不低于10cm。次年春天当土壤解冻，牧草开始返青前后，即可到田间检查返青植株数。在内蒙古西北地区由于气候干燥，温度低、死亡的植株未腐烂掉，因而返青二周内做一次调查即可。春季测定是在田间直接检查，选1m长、二行的样段3—5个，在选好的样方或样段上，用铁锹、小铲取掉植株周围的土，露出根颈部，并使各植株之间彼此分离而便于计数。越冬率的计算方法为：越冬率=返青植株数/植株总数×100%例如在样点上原有植株150株，返青后调查只有120株，其越冬率为80%。入冬前未确定样方的，也可以在春季返青时随机地抽取样方，检查存活植株数和死亡植株数，两者之和为植株总数，然后计算越冬率。统计时将那些长出绿叶、新芽或幼芽突起，以及虽然没有幼芽萌发，但根颈部颜色正常，没有枯黄变色，根变细嫩光滑的归于存活植株一类中去。将根颈腐烂发黑，没有新芽发生的归于死亡植株。春季测定法因为简便易行，所以在越冬率测定中最为常用。进行本实习时，必须密切注意当地冬春季节的气象记载。四、作业将本组越冬率测定的结果写成报告。

实验三无性系的建立一、目的无性系建立是多年生豆科牧草育种很重要的技术工作。它对培育自交系，自交系结合力的测定、优良个体的扩大繁殖和配制杂种种子等方面的工作，都是不可缺少的。二、材料以苜蓿为代表建立无性系。用枝条来扩大个体数量。这个方法对大多数豆科牧草都是适用的。三、用具剪刀、米尺、烧杯或塑料薄膜，8号铅丝、记录本、整地工具、水桶、喷壶。四、方法及步骤苜蓿的根、茎、叶均可进行无性繁殖，其中以茎段扦插建立无性繁殖系最为便利，原因在于：茎的数量较多，可以同时扦插很多单株而不损伤母株。扦插又不需要过高的设备条件，大田条件下就可以进行；苜蓿根茎分株繁殖，虽然也不需要很高的条件，但是分根的数量有限，而且母株只能利用一次；叶片繁殖需要较高的条件、而叶繁殖幼苗生长速度亦不如茎条扦插。现以苜蓿茎条扦插为例，具体介绍无性系建植的方法与步骤。开花以后扦插，成活率逐渐降低。从植株生长发育状况来看，春季返青后株高达30cm左右的枝条即可扦插。苜蓿扦插的最适宜时期是孕蕾前期。这时扦插成活率很高，而且能繁殖较多的数量。内蒙古自治区呼和浩特地区是在5月上旬，这个时期扦插当年还可以收到种子。扦插苗床在扦插前要施足基肥。根据扦插目的的不同，可以采取不同间隔距离。每个苗床面积，20×20cm足够。苗床应低于地面4cm以便浇水。扦插前应先灌足水分。由母株基部剪取的枝条，需要修整后再扦插。每个插条要求在其顶端保留一个叶节。扦插条的长度不限，视品种的节间长度而定。因此每个枝条应在叶节的上部靠近节的地方来剪取。剪掉小叶保留托叶内的腋芽。一般一个插条约为5cm长，个别长的可达10cm。短的2—3cm都可以成活。这样剪法，一株母株可繁殖50株左右。将准备好的插条，插入土中，每苗床2—4株，株距2—5cm，叶节留在齐地面处，插好后再灌少量水，以使与土接触紧密便于吸水。如在4月底到5月初扦插，每个苗床扦插后应随即盖上塑料薄膜以保持湿度。如在5月到6月初扦插不需覆盖塑料薄膜，如果覆盖反而会引起幼苗死亡。插后的管理，每天给苗床浇水一次，保持其湿度。在生长季节中光和温度勿须特殊调节，自然状态可满足插条幼苗生长的需要。扦插四周后，茎条开始生根，地上部分可达10—15cm，植株开始独立生活。五、作业每人扦插20个插条，扦插后注意灌水。一周后调查扦插存活率，写出实验报告。

实验四牧草开花习性的观察方法一、观察牧草开花习性的意义观察牧草开花习性主要是了解牧草的开花时间、开花动态及其授粉类型，为杂交育种及一些牧草的人工辅助授粉提供依据。二、实验材料和设备田间记录本、放大镜、镊子、小剪刀、干湿球温度计、标签、铅笔、量角器。三、开花习性观察时需注意的几个问题1.选好样地：样地要有典型性，密度适宜，生长发育良好。一般在2×5m2的试验小区内选择10个花序为宜，挂好标签，写明日期。2.开花标准问题：（1）豆科牧草开花标准：以旗瓣向外开展，尤骨瓣露出翼瓣之间为准。（2）禾本科牧草开花标准：外稃向外开张一定角度，柱头露出、花药下垂为准。3.观察开花习性的时期问题：一年生牧草可于播种当年进行观察，对于多年生栽培牧草以生活第二年观察为宜。因为这个时期牧草生长旺盛、枝叶繁茂，开花最为正常。4.气候条件对牧草开花有一定影响。在进行开花习性观察时，应进行温度和相对湿度的观察，同时也要记载观察期间的天气状况，如风、雨或阴天等，以便作为开花习性综合分析时的参考。四、开花习性观察的内容和方法（以禾本科牧草为例）：1.开花期、开花持续期的观察方法在栽培小区上，分布均匀地在全小区范围内选择孕穗及抽穗（豆科牧草：孕蕾或现蕾）的花序100个，挂牌标记，逐日记载已开花的花序数及其日期，直到全部挂牌的花序开花为止。观察完毕后，通过开花的起始和结束时间，得出开花的延续期；同时统计每日开花的花序数占观察总数的%，并以曲线图示，以了解草群群体的开花动态及开花的整齐度。2.开花顺序的观察方法：牧草开花是按一定规律进行的。一个穗子上的小花或自下而上，或自上而下开放，或是从中部小花开始向上、下部小花开放，其时间早晚是不同的，因而也影响了种子成熟的一致性及泡满度。观察开花顺序时一般采用图式法，即在抽穗期选取所观察牧草的10个花穗，挂牌标记。各张纸上绘上每一穗的开花图式（如图1）。图中自下而上以1、2、3、……19代表花序的各个小穗数，小圆圈代表小穗上的小花。每小穗基部近穗轴的小花是小穗的第一朵花，接着是第二朵花、第三朵花……。考虑到牧草白天、夜间均有开花的可能，因此，从零点至二十四点内，每隔二小时观察一次，并在图式上注明已开的花及日期。为清楚起见，可仿照图式把同一天开放的花用线连接起来。开花全部结束后，确定每个花序和花序上小穗的开放顺序及开花时间的长短。图1牧草开花顺序示意图3.一穗开花动态的观察方法在草群中分布均匀地选取10个花序，挂牌标记，逐日按时分别观察记载其已开花的小花数，记载完毕后，要用剪刀剪去已开放的小花的雄蕊，直至10个花序开花完毕，统计10个花序在开花期内的开花总数，并计算出逐日开花数。4.一日开花动态的观察方法在试验小区上均匀分布地选取10个花序，挂牌标记，从草群大部已进入开花时，连续三日自早至晚，每间隔1小时，统计各穗已开花的小花数及10穗总和。观察完毕后，随即用剪刀剪除已开放小花的雄蕊，并记载该时间的气温及相对温度。三日后，统计在三日不同时间内的开花总数，计算出其百分比，并绘图表示，了解一日开花起讫时间及大量开花时间与天气状况的关系。5.小花开放情况的观察方法在一日内的开花高峰时期，选取5—10朵未开，但即将就要开放的小花（在阳光下外稃略呈透明状、隐约可见花药），挂牌标记。此后对每一小花的开放进行持续观察，了解其由内外稃开始开张，到花药下垂散出药粉，直至内外稃完全闭合全过程的开放情况，并分别记录下由内外稃开始张开到雄蕊露出、花药下垂、散粉、内外稃开始闭合、内外稃完全闭合等各开花过程所需的时间（以分钟计），以及各过程中内外稃开张的角度。6.授粉特点及结实率的观察：在植株群体大量抽穗后但尚未进入开花期时，从中均匀地选取100个花序，用羊皮纸（或硫酸纸）纸袋套袋隔离，使其自花授粉，其余末套袋的花序作为自由授粉处理。待全部植株开花完毕后，取下纸袋，挂牌标记。种子成熟后，将套袋的花序取下，并取同等数量的自由授粉花序，分别统计上述二种花序一穗或总穗数的小花数，然后分别脱粒，统计出结实种子数，得出该种牧草自交和异交结实率。五、作业每一学生要写出一篇供试牧草开花飞性的观察报告。

实验五花粉生活力测定一、实验目的学习并掌握测定植物花粉生活力的技术和方法。二、实验材料主要牧草及饲料作物（如紫花苜蓿、红豆草、老芒麦、冰草、玉米、燕麦等）的新鲜、花粉、陈花粉及其相应植株。三、实验用具、药品显微镜、解剖针、摄子、棕色滴瓶，吸水纸、凹片，载玻片、盖玻片；碘-碘化钾、醋酸洋红、联苯氨一甲奈酚（1，2，3，4号），氯化三苯基四氮唑。四、说明花粉生活力的强弱是植物有性杂交能否成功的重要影响因素，而花粉缺失活力又是花粉败育型雄性不育系的主要特征。故此，花粉生活力测定是进行有性杂交育种和雄性不育系鉴定必不可少的工作。测定花粉生活力的方法较多，有直接法（检查人工授粉结实率）、培养基发芽法、花粉鉴定法以及化学试剂染色法等。本试验着重练习如下三种方法。五、方法与步骤（一）形态观察法每组取2个凹片分别选取两种供试材料的新、陈花粉，滴入半滴蒸馏水，调匀，在低倍镜下检查花粉形态。凡内含物充实饱满者为正常、具活力的花粉，而那些瘦小、畸形或内含物较少的花粉粒则为无活力型。观察时取若干个视野，总共统计200粒花粉的活力情况，并绘制每种植物正常具活力的花粉粒图。具体的观察结果可依下表所给格式记载并统计。表1花粉形态观察结果统计表供试植物花粉种类充实饱满数畸形瘦小数具活力花粉的%新鲜陈新鲜陈（二）化学试剂染色法1.碘-碘化钾染色法每组取2个凹片，分别选取两种植物的新、陈花粉，放入凹槽内，滴入一滴1%的碘-碘化钾溶液，盖上盖玻片染色。20分钟后用低倍显微镜检查着色情况。凡着色者为有生命力花粉粒，着色浅或不着色者则无生活力。观察时分别取若干视野统计200粒左右花粉的着色情况。2.醋酸洋红染色法染色、观察及统计方法与1法相同，但染色时间应以3—4分钟为宜。3.联苯胺—甲萘酚染色法（Wapgakof法）按上述方法取一种植物的新、陈花粉置于载玻片上，加入联苯胺-甲萘酚①②③的混合液及④溶液各一滴，调匀，盖上盖玻片，经3—4分钟检验，凡有活力的花粉，其过氧化氢酶具活性，使氧活化成为活性氧，该活性氧使该试剂染色。故此具生活力的花粉被染成红色，而无活力的花粉则着色很浅或几乎不着色。观察结果也依前述方法进行统计。4.红四氮唑（TTC）染色法染色方法同3，只是在染色后置于35—40℃下15—20分钟，统计方法同上。上述四种方法的观察结果，可依下表给定格式记载并统计表2化学染色法测定花粉生活力统计表供试植物花粉种类碘—碘化钾醋酸洋红联苯胺—甲萘酚TTC着色数不着色着色%着色数不着色着色%着色数不着色着色%着色数不着色着色%新陈新陈（三）直接法（人工授粉结实率检查法）在田间，每人选5个禾本科牧草的花穗，开花前一天整穗，每穗选留下5—10朵小花，并去雄套袋；第二天分别用新鲜花粉，放置2小时、4小时和6小时的陈花粉授粉及套袋。结实期时通过观察结实率，以测定各类花粉的生活力，结果填入下表。表3禾本科牧草（冰草或披碱草）花粉田间检验统计表花粉种类结实情况授粉穗数授粉小花数结实数结实率（%）新鲜花粉放置2小时放置4小时放置6小时作业：1．完成上述试验统计表2．绘制两种牧草正常有活力的花粉形态图附：试剂配制1.1%碘—碘化钾溶液KI溶于少量蒸馏水中，再加1g碘片，定溶至100ml，贮于棕色瓶中。2.醋酸洋红（同染色体镜检所用试剂）3.联苯胺—甲萘酚①0.2g联苯胺溶解在100ml50%酒精中；②0.15g甲萘酚溶解在100ml50%洒精中；③0.25g碳酸钠溶解在100ml50%洒精中；④实验前配制3%过氧化氢溶液。第①②③各液，于使用前等量混合并存于棕色滴瓶中4.0.5%氯化三苯基四氮唑先称取0.832gNa2HPO4·2H2O和0.27gKH2PO4溶于100ml蒸馏水中，配成PH7.17的磷酸盐缓冲液，再称取0.05g氯化三苯基四氮唑溶于新配成的10ml磷酸盐缓冲液中，存于棕色瓶中。

实验六花粉萌发试验一、目的和意义在牧草杂交育种工作中，特别是在远缘杂交中，往往会发生由于雌雄器官在形态构造上的不同以及两性细胞在生物学上的极不适应，而造成花粉不能在异种植物柱头上萌发；或花粉管生长受阻，不能伸入胚囊到达胚珠；或花粉管到达胚囊，但不能正常受精；或胚胎不能正发育等等。由于这些原因，品种间或种间杂交常难以成功。因此，了解牧草的开花可性，授粉机制以及胚胎发育状况，是进行杂交试验的基础性工作。本试验的目的，在于通过花粉镜检，了解花粉的活力以及花粉在柱头上的萌发情况，为杂交育种提供细胞学依据，使学生掌握进行该类试验的基本方法和操作技能。二、材料、用具和药品苜蓿不同的种和品种。显微镜、解剖镜、镊子、骨勺、解剖针、双面刀片、载玻片、培养皿、小烧杯、小瓶、隔离纸袋、标签、吸水纸、水溶性苯胺兰乳酸、苯酸、酒精（95%、70%）、冰醋酸、蔗糖、琼脂、蒸馏水等。三、方法和步骤（一）实验前的准备：应预先配制如下溶液。1.卡诺固定液（无水酒精：冰醋酸=3：1）2.培养基：蔗糖10克，0.1%硼酸数滴，加水至100毫升，再加1克琼脂，加热熔融，分装在培养皿中。3.乳酸—棉兰染色剂：乳酸、苯酚、甘油、水等量混合在以上溶液中溶解0.1%的棉兰。（二）操作方法和步骤1.授粉：在牧草开花期选择健壮无病的植株，用镊子夹掉花序下部已开放的小花和上部发育不全的小花，只保留旗瓣已张开，而龙骨瓣未张开，花药尚未弹出的几朵小花。用牛角勺按一下父本小花的龙骨瓣基部，花丝管下弯，花药弹出，在匙上留下小堆花粉。用同样的方法接触母体小花，使其柱头接触匙上的花粉，授粉即已完成。然后套袋隔离，在标签上写明授粉的确切时间。2.取材固定授粉后头一小时内，每隔10分钟取样；从第二小时起，每隔一小时取样，用摄子将已授粉小花的花萼、花冠去掉，放入小瓶内用卡诺氏溶液固定0.5—24小时，再移至70%酒精中保存。实习时为方便起见，也可将已授粉的小花剪下，放入糖浓度为10%的固定培养基上，随时取下柱头进行观察，也可将已授粉的小花置于空的培养皿中，皿内滴几滴水，盖上盖子以防柱头干枯。然后每隔一定时间取材观察。3.染色制片采用乳酸棉兰染色法。先将小花置于载玻片上，去掉花萼、花冠。左手用镊子压住基部花托，右手用尖的解剖针轻轻划破花丝管，并将子房和花托剥离，用镊子轻轻取出雌蕊，去掉花丝管。将雌蕊放在载玻片中央，滴一滴乳酸—棉兰染色液，静置5—20分钟。然后盖上盖玻上，上附吸水纸用手轻轻往下压，使柱头、花柱和子房展平，用吸水纸吸去多余染液。4.镜检：将做好的片子放在低倍镜下进行观察，可以看到：柱头、花柱及败育花粉几乎透明，而有生活力的花粉及花粉管被染成天兰色。注意观察花粉粒、柱头和胚珠的形态特征，并与未经染色的作比较。观察的同时按表1的要求统计出授粉后各时间段内花粉的萌发率及花粉管萌发及伸长情况，并阐明花粉在柱头上萌发的最初时间。感兴趣时，同学们也可统计雌蕊子房中的胚株数目（统计10个材料，取平均数）。如欲制成永久制片，可将临时压片反转后置于盛35%酒精的玻璃器皿中，脱下盖玻片，将材料置于载玻片上，依次滴上50%、70%、95%、100%酒精脱水，每次3—5分钟，用吸水纸吸干残液后再进入下一步聚。然后依上法用1/2的纯酒精，1/2二甲苯脱水透明，加拿大树胶封片即成。表1××牧草花粉的萌发情况花粉萌发授粉后时间柱头数花粉粒数检查数发芽数总数%花粉管伸入花柱数目%1小时10″20″30″40″50″60″2小时3小时作业：完成上述完整试验操作，将观察数据填入表1。

实验七禾草的有性杂交技术一、目的熟悉禾草的有性杂交技术，以便在育种工作中应用。二、材料和设备数个不同的冰草品种，小剪子、镊子、隔离纸袋、标签、毛笔、铅笔等。三、方法和步骤（一）冰草的花器构造及开花习性冰草为较紧密的穗状花序，两侧压扁。每小穗具3—11小花，小花具内稃和外稃，之间有雄蕊3枚，雌蕊1枚，柱头呈羽毛状。花药较大，约4mm左右。冰草属异花授粉植物，自交不育。其穗状花序的开花顺序，就一穗而言，先从上部的小花开起，逐渐向上、下开放，基部小花最后开放。而小穗的开放顺序则是从基部小花开起直到顶花。冰草在一天内的开花时间是从上午11时持续到下午6时，大量的开花时间是下午2—5时。（二）有性杂交方法：1.不去雄杂交法（1）互为父母本法将父母本相邻种植，开花前将父母本花穗用隔离纸袋套在一起，花期抖动纸袋数次，以促进散粉，这样可得到二个杂交组合（即互为父母本）的种子。（2）采集父本穗授粉法如果拟杂交的父母本没有相邻种植，在田间有一定距离时，可采用此法。在开花前用隔离纸袋将母本穗（约3—5个）套上，并把它固定在竹杆或其他支撑物上，以防倒伏和折断；当父本穗小花开放时，剪下父本穗子（3—5个），与隔离袋中的母本穗放在一起，使其为母本穗授粉。然后将纸袋封好，以防其他品种的花粉混入。如有必要，可连续二次授粉。用不去雄授粉法搞杂交，手续简便，对母本柱头的损伤小，杂交结实率高，是异花授粉植物杂交中较常用的方法。2.去雄杂交法冰草虽是异花授粉植物，但其自交结实率有时会高达7%，为严格起见，需采用去雄杂交方法，其操作步骤如下。（1）整穗：在母本行内选择具有代表性生长健状的植株，当其穗部抽出剑叶3cm左右时，透过外稃可以看到花药呈黄色，此时便可进行整穗。也可选择个别小花已开放的穗子，剪去发育不良和已开花的小穗，每穗只在中上部留下5—10个小穗，每个小穗留下基部2个左右小花。当小穗过于紧密有碍授粉时，可以间隔去小穗。（2）去雄：整好穗后，立即进行去雄。去雄时用左手大姆指和食指轻轻捏住小花基部，右手轻轻用镊子把内外稃拨开，小心地把三个雄蕊去掉，注意不要挟破花药，更不要用力过大损伤内外稃和雄蕊。去雄后，让小花恢复原状，再去下一个小花。去雄完毕后，套上隔离袋（袋子大小为6×12cm），并挂上标签，写上父母本的各称和去雄者以备杂交。（3）采集花粉花粉采集应在开花盛期到来之前进行。在父本行内选择典型的，生长健状的植株，采集其花药未破裂的成熟花粉，此时花药呈黄色。采集足够数量后，把花药破碎，再进行授粉，切勿采集绿色花药，否则杂交不易成功。（4）授粉在母本去雄后的第二天下午2—5时，进行采花粉和授粉为宜，此时为一日内的开花高峰期。授粉时先把母本隔离袋取下，用毛笔沾少量的花粉置于母本羽状柱头上，并轻轻地擦动。待全部小花授粉完毕，再用隔离袋将母本穗套起来，以防其他花粉进入。最后在标签上注明授粉日期。隔离袋可以一直不取，直到成熟时按组合分别收获为止。标签的设计方法及记载项目可参考下面格式：组合组合♀×♂____________________去雄方法__________________去雄日期__________________杂交者__________________四、作业每人杂交2—5穗，收获时统计杂交结实率。

实验八豆科牧草的有性杂交技术一、目的熟悉豆科牧草的有性杂交技术，以便将来在育种工作中能加以运用。二、材料和设备黄花苜蓿（或杂花苜蓿），紫花苜蓿、小剪刀、骨勺、镊子、标签、棉花、放大镜、75%酒精、铅笔（自备）。三、方法和步骤（一）苜蓿的花器构造和开花习性苜蓿为总状花序，蝶形、两性花、有旗瓣一枚、翼瓣二枚、龙骨瓣二枚，雌蕊一个，雄蕊10个、呈九合一离，九个雄蕊聚合成雄蕊管。苜蓿为无限花序，全株开花的顺序是自下而上，自内而外。在一个总状花序上开花的顺序也是自下而上。一天中，5—17点钟均有开花，但开花最盛时期是在午前9—12点钟，小花的开放时间可持续2—3天，苜蓿为虫媒花，自花授粉是高度不孕的。（二）有性杂交的技术：选取位于主茎上的花序用作杂交。在准备杂交时，用剪刀剪去花序下部开放的全部小花和上部发育不全的花蕾，只留下花冠比萼长一倍，而花药的形态呈球状一团的小花备去雄之用。去雄时用镊子去掉花药。即用镊子把遮盖着龙骨瓣的旗瓣和翼瓣向一旁折转，用尖锐的镊子沿着龙骨瓣切开，并轻轻地将其向旁边折转，即可见到雄蕊，然后小心地用镊子夹去花药。杂交最好在晴朗无云的上午进行，6—9时去雄，10—12时授粉。去雄还可以采用酒精浸渍法，该方法如下：准备60毫升95%的洒精和40毫升水，将酒精与水混合。选旗瓣与翼瓣已经张开但龙骨瓣未张开、雄蕊管尚未弹出的花朵进行杂交：修剪去其他不符合标准的花朵。将准备去雄的总状花序浸入洒精与水的混合液中5秒钟，取出后立即用水冲洗，30分钟后即可授粉。此法几乎可以达到完全去雄的效果。授粉时从父本植株上选择尚未开放的、发育良好的花序。为了获得花粉，用不锐利的骨勺或木制小匙伸到父本的花中，在小勺压迫龙骨瓣基部的情况下，花便开放，雄蕊和雌蕊有力的弹出，把一堆花粉留在小匙上。对母本小花也实施同样的操作，使雌蕊柱头刚好碰到从父本上取来的那堆花粉。去雄和授粉后用棉花或纱布裹起母本花序，并挂上标签。苜蓿自花授粉高度不孕，很容易与他花授粉（柱头具有选择性）。因此在育种实践上多数采用不去雄杂交法，即母本不去雄，直接授以父本的花粉。应用这种杂交方法时，母本的花朵应该选择旗瓣与翼瓣已经张开，但龙骨瓣未张开，雄蕊管未弹出的花朵进行杂交；父本也采用同样的花朵用骨勺采集花粉。授粉完毕后立即用棉花包裹起花序，并挂上标签。四、作业每人杂交6个花序，其中不去雄杂交法4个，镊子去雄1个，酒精去雄法1个。待种子成熟后收获杂交种子并统计杂交结实率。

实验九饲用玉米自交杂交技术一、目的掌握玉米自交、杂交技术。二、材料及用具玉米的自交系、玉米普通品种、羊皮纸袋（40×20cm），硫酸纸袋（20×25cm×10cm），曲别针、线绳、小刀、小剪刀、纸牌、75%酒精、棉球、铅笔。三、实习说明玉米是雌雄同株异花的作物，雄花生长在株顶，雌花生长于茎杆中部。一般雄花先开，天然异交率95%左右，玉米雄穗由主轴和侧枝组成，可产生大量花粉，花粉靠风力传播，一般传播距离为2—3m，远的可达500m以处。玉米抽雄后2—5天开始散粉，每日开花时间以上午9—11时开花最盛，一株雄穗可连续开花7—8天。在一般田间条件下花粉的生活力可维持5—6小时。在温度为5—10℃，相对湿度为50—80%的条件下，生活力可维持24小时以上。雌穗为肉穗状花序，由腋芽发育而成。穗外被有苞叶，中部为穗轴，成对雌小穗着生于穗轴上。每个雌小穗有两朵小花，其中一朵退化，另一朵小花结实，形成并排的籽实两粒，故果穗上的籽粒行数为偶数。雌小花由内外颖和雌蕊组成。雌蕊有一处圆形子房，顶端着生有茸毛的丝状花柱（花丝），能分泌粘液粘着花粉，花丝各部均有受粉能力，爱精后花丝枯萎，子房发育成种子（果实），花丝伸出苞叶为开花，花丝受粉能力可维持10—13天，但以抽出后的2—6天内受粉最好。雌穗一般在雄穗散粉后2—4天抽丝。四、自交和杂交方法1.雌穗套袋：选群体中优良单株5—10株，当雌穗尚未抽丝时，用硫酸纸袋套上，再用曲别针将袋口夹住或用线绳系于茎杆上。2.雄穗套袋：根据不同的要求套采粉的雄穗。若是自交，应套在本株的雄穗上；若是杂交，则套在父本株上。套袋时，用羊皮纸袋将雄穗全部套住，将袋口合扰并用别针夹紧，在袋上注明套袋日期。3.人工授粉：雄穗套袋36小时后，附着在雄穗上的外来花粉全部死亡，即可授粉。授粉分采粉和授粉两个步骤，采粉时将雄穗稍稍弯下用手指轻弹纸袋，使花粉落在袋内，然后取下，紧闭袋口。授粉前，取下雌穗上的袋检查，如果花丝过长，用剪刀剪去一部分，立即用收集的花粉授粉，授粉完毕，雌穗仍套上纸袋，挂上纸牌，写明组合名称，授粉方式（自交或杂交），授粉日期和授粉者姓名。五、作业按上述方法步骤做自交、杂交各两个果穗，成熟时分别收获，统计结实率。

实验十植物根尖细胞压片法一、实验目的植物根尖细胞压片法，是一种快速简易制片法（与石蜡切片相比）。根尖分生组织取材方便，易于识别，若用种于萌发直接取根样又不受季节影响，其优点为其它材料所不及，因而在观察、鉴定植物染色体时为人们所常用，成为染色体计数、核型分析、分带研究的重要手段。本实验要求学生熟悉并掌握植物根尖细胞的固定、染色、制片方法以及镜检技术。二、实验材料蒙古冰草（2n=14）、紫花苜蓿（2n=32）三、实验器具、药品器具：温箱、冰箱、显微镜、培养皿、解剖针、解剖刀、镊子、酒精灯、载玻片、盖玻片、青霉素小瓶、滤纸、铅笔等。药品：70%酒精，95%酒精、冰醋酸、45%冰醋酸、1N盐酸、浓盐酸、卡诺固定液、0.002M8—羟基喹啉、对二氯苯-α溴萘混合液、醋酸洋红、醋酸地衣红、石碳酸品红、铁矾苏木精。（配制方法见本实验附录）四、实验步骤及说明（一）材料培养将试验用材料的种子清洗干净，用温水浸泡使其充分吸胀，然后将吸胀种子涝出，置于垫有滤纸的培养皿中，放在温箱中（约25℃）使其萌发（每天用温水洗涤1—2次）。待幼根长到1cm左右时，剪取根尖，进行预处理。（二）预处理目的使染色体缩短，利于染色体分散；同时可累积比较多的细胞处于有丝分裂中期的分裂相。方法：从蒙古冰草或紫花苜蓿的幼根上剪下长度约为0.5mm的根尖，放入盛0.002M8—羟基喹啉（或对二氯苯-α-溴萘混合液）的青霉素小瓶中，室温下处理3—4小时。说明：观察染色体数目，首先需掌握细胞的分裂时间。一日之内，分生细胞的分裂颇有规律，上午、下午及夜间各有一细胞分裂高峰期，细胞分裂最多；作为染色体数目观察的细胞最适期是在有丝分裂中期，此时染色体缩到最短，且集中到赤道板上呈一平面排列。因此，只有在细胞分裂的最适时期取样并预处理，方能获得满意的结果。蒙古冰草及紫花苜蓿的取样时间均以上午9时左右为最好。（三）固定目的利用化学药品将活细胞迅速杀死，使核蛋白变性或沉淀，以保持染色体固有的形态和结构。方法：倒掉预处理液，水洗1—2次，而后将根尖放入卡诺固定液中（固定液要现用现配），固定2—24小时。材料小者易短，大者易长。说明：经固定的材料，若不及时压片，可转到70％的酒精中置0—4℃冰箱中长期保存备用。（四）解离目的将细胞壁之间的果胶层用酸水解，使细胞易于分散，细胞壁软化，便于压片。方法：将固定材料放入50%酒精中浸泡3分钟，而后用蒸馏水冲洗并吸干，转入1NHCl（60℃）中，解离20—30分钟。解离后的材料需用1N冷盐酸浸泡2—3分钟，再用蒸馏水冲洗2—3次。说明：解离的时间需严格掌握，过短细胞不易分离；过长又会使细胞变长，影响染色。适宜的解离时间，因材料而异。（五）染色、压片（1）醋酸洋红、醋酸地衣红、石碳酸品红染色压片法用解剖刀或双面刀片从根尖处切下极小的一段（0.5mm左右），置于载玻片上，滴一滴染色液，然后加盖玻片。染色约5分钟后，取一滤纸，覆在盖玻片上，在不移动盖玻片的情况下，左手固定滤纸，右手拇指垂直向盖片加压，使根端部组织分散摊开，呈一薄层，以待镜检。如染色浅，可沿着盖片滴加染液，待渗入后微烤，可使染色体加深着色；如染色较深，可沿盖片一侧滴加45%的醋酸，另一侧用滤纸吸染液并微烤，（2）铁矾—苏木精染色压片法解离并经水洗后的根尖材料，用4%的铁矾水溶液媒染60分钟或更长时间，水洗数次，再用0.5%苏木精染色液染色（约60分钟），水洗10分钟后分色软化（45%醋酸10—20分钟，1%氨水1分钟），然后取根端黑色部分置于载玻片上，切碎或捣乱，滴加45%醋酸数滴，压片。用此法染色，媒染一定要充分，媒染后水洗要彻底，分色软化要适宜，最终使染色体呈兰黑色，细胞质为淡兰色或近无色。（六）镜检将制好的临时压片置于显微镜目镜下观察，先用低倍镜找出较为理想的视野及典型的分裂相，再选用高倍镜详细观察描述并计数。一旦发现理想的分裂相，有时还需作标记。其方法是将标记细胞放在低倍镜视野中央，然后用一张与载玻片大小相仿的滤纸中心剪一洞，将滤纸小洞置于低倍物镜下光路通过的位置，此位置便是欲标记细胞在玻片上的所在位置，这时将滤纸与玻片压紧从镜台上取下来，用防水绘图笔在载玻片反面正对滤纸小洞处划一圆圈，然后去掉滤纸再在盖玻片上沿反面圆圈的位置划一同样的圆，则标记完毕。制成的片子如只需临时保存，最简单的方法是在大小适宜的培养皿中垫一层潮湿滤纸，其上放数根牙签，然后将制片的盖片一面朝下放置在牙签上，再加盖皿盖防水分蒸发，此法可使制片保存数天。如临时片制成后，来不及立即完成观察分析，就有必要制成永久片，以供日后观察、研究和显微摄影之用。（七）永久片制作（1）简易制片法（介绍两种）①将具优秀分裂相的制片置冰箱的冷冻室内，待完全冷冻后，用单面刀片将盖片揭开，然后把载片和盖片同时置于37℃—40℃的烘片台或温箱中烘干（或室温下晾干），取出后在二甲苯中浸泡10—20分钟，用加拿大树胶将盖片、载片分别封片。②冰冻揭片后，将制片放入95%酒精中1—2分钟，再放入纯酒精中1—2分钟，然后用Euparal胶封片。（2）酒精一叔丁醇脱水封片法准备4套直径约12cm的培养皿，编号，每一培养皿中放一短玻璃棒，然后顺序加入下列溶液。1.1/295%酒精+1/245%醋酸2.95%酒精3.1/295%酒精+1/2叔丁醇4.叔丁醇操作时，将临时压片的盖片一面朝下，浸入盛溶液的1号培养皿中，让玻片一头置于玻棒上，使盖片自行滑下，盖、载片脱落，依次经2、3培养皿，最后至叔丁醇，每次5—10分钟；从叔丁醇取出后，即可用溶于叔丁醇的加拿大树胶封片，晾干后保存。（3）酒精—正丁醇脱水封片法参照（2）的方法，将临时制片顺序放入下列溶液脱水：1.1/295%酒精+1/2冰醋酸2.2/395%酒精+1/3正丁醇3.1/395%酒精+2/3正丁醇4.正丁醇制片需在1号溶液中浸泡5—6分钟，2—4号溶液中浸泡2—3分钟，最后用溶于正丁醇的加拿大树胶封片，凉干后保存。作业：1.每人交一张具有丝分裂中期相的优良制片，并加以绘图。2.利用临时制片，每人制作两张永久制片。说明：该实验需时较多，实验教师可酌情将其一分为二，先做根尖细胞的染色体镜检；第二次可在前面的基础上练习制作永久制片。附录：有关药品的配制：1.卡诺（Carnoy）固定液：卡诺I：冰醋酸1份纯洒精3份卡诺II：冰醋酸1份（用于含油脂类物质较多的材料以及某些需要更加硬化的组织的固定）氯仿3份纯酒精6份2.当量盐酸的配制用酸滴定管取浓盐酸配成所需当量浓度的盐酸。加水至1000ml0.2ml19.66ml加水至1000ml加水至1000ml3.用95%酒精配制各种浓度酒精的方法原则上稀释多大浓度就取多少毫升的酒精，例如配70%酒精，则取70毫升95%的酒精，加蒸馏水量为原有浓度减去所需稀释的浓度数，本例即为25毫升（95减去70）4.0.002M8—羟基喹啉—羟基喹啉置1000ml蒸馏水中。因本药难溶于水，需将溶液置60℃左右的温箱中数小时，待其完全溶化后，取出冷却至室温贮存备用。5.对二氯苯-α-溴萘饱和水溶液称取5克对二氯苯结晶放入棕色试剂瓶中，加入100毫升加温至40—50℃的蒸馏水，振摇约5分钟，使其溶解，冷却至室温后加入1滴α-溴萘溶液，充分振摇后静置，待溶液澄清后即可使用。该混合液作用力强，作用迅速，非常适合于具大染色体植物材料的预处理，在较短时间内可使染色体明显缩短。此外，也适用于以计数染色体为目的的预处理。但该混合液对细胞的毒害力也较大，要严格控制处理条件（温度不能过高，10—20℃为宜，时间不能过长），否则易导致染色体严重粘连、聚缩成团等。另外，该混合液稳定性稍差，使用一周后，其效力明显下降，故不宜配制后久存。6.1%醋酸洋红先将100ml45%的醋酸水溶液放在较大的锥形瓶中煮沸，移去火苗，徐徐加入1克洋红粉末，煮沸1—2分钟，放入一铁针，过1分钟取出（或在冷却后加入醋酸铁1—2滴），使染色液略具铁质，静置12小时，过滤于棕色试剂瓶中，可长期保存。7.醋酸地衣红醋酸地衣红配法基本上与醋酸洋红相同，但无需加铁质作媒染物。8.4%铁明矾称取4g铁明矾，溶于100ml的温热蒸馏水中（50℃）即可。铁明矾为紫色结晶，若为黄色则不能用。此液最好现用现配。9.0.5%苏木精染色液取苏木精结晶0.5g，溶入10ml95%的酒精中，待充分溶解后再加入90ml蒸馏水，瓶口敷以纱布，放置1个月左右，染色液即充分成熟便可使用。有时也可将苏木精先配成10%的基液，便于长期贮存，需用时，再稀释到0.5%（用5ml基液，加95ml蒸馏水即可）。10.卡宝品红（或称石碳酸品红）这是目前在国内应用最广泛的一种优良的染色剂，其优点染色快速而操作简便，一般只对核和染色体深染。此外，药品价廉，染色液稳定为其它药物所不及。配方如下：原液A：3克碱性品红溶于100毫升70%酒精中（此液可长期保存）。原液B：取原液A10毫升，溶入90毫升5%的石碳酸（苯酚）水溶液中（限2周内使用）。原液C：取原液B55毫升，加入冰醋酸和甲醛各6毫升（可长期保存）。染色液：取原液C10—20毫升，加入45%冰醋酸80—90毫升，再加入1克山梨醇。该染色液配制1—2周后即可使用，室温存放，一般可保存两年而有效。如发生沉淀，过滤后即可用。用卡宝品红染色的材料，必须经盐酸解离，盐酸处理时间要控制好，时间短细胞质也不同程度地着色；处理过度，则染色体着色浅淡。盐酸处理后必需用水彻底清洗。否则，也难以着色。

实验十一植物染色体核型分析一、实验目的及说明本实验的目的是：要求学生掌握利用有丝分裂中期的染色体进行核型分析的方法。核型亦称染色体组型，是指体细胞有丝分裂中期细胞核（或染色体组）的表型。它是物种特有的遗传信息之一，有很高的稳定性和再现性。核型分析就是对每一物种的染色体进行分组，并对细胞核中染色体的数目、各染色体的大小和形态特征进行综合描述。掌握核型分析方法可帮助鉴别真假杂种，了解染色体畸变类型，探讨特种起源和进化途径。它是细胞遗传学的一项基本技术，也是染色体工程、细胞分类学和植物育种学的一种不可缺少的手段。进行核型分析，首先要制作该物种有丝分裂中期的优良染色体标本，要求细胞内染色体缢痕、随体清晰可见，无重叠或重叠少形态可辨，染色体不扭曲，不断裂，长度适中，细胞轮廓清楚。还要通过显微摄影，冲洗放大获得染色体相片，供组型分析用。取样的细胞数目：作核型分析，研究染色体形态以来源于不同个体5个以上的细胞为准（原则上越多，准确性越高，有用10个甚至20个的）。染色体计数，统计的细胞数目应在30个以上。二、材料和用具1.材料：蒙古冰草、紫花苜蓿根尖染色体标本制片10张以上；5个分裂中期细胞的染色体相片，每细胞洗1张，其中选一最好的加洗1张，作为模式照片。2.用具：毫米尺、剪刀、镊子、计算器、铅笔、绘图纸、座标纸、显微测微计等。三、实验步骤（一）染色体计数将蒙古冰草（或紫花苜蓿）根尖染色体制片，置显微镜下，选取有丝分裂中期30个以上可计数染色体的细胞分别计数，其中85%以上的细胞染色体如恒定一致，即为该材料的染色体数。（二）排列核型图1.测量和求出放大倍率：先在放大照片上分别将每个细胞内的染色体随意编号（以利记载），然后依次测量出每条染色体的长、短臂长度（从着丝点中部量到每个臂的端部），并据此计算出每条染色体的全长和臂比值（长臂/短臂）。随体长度可计入也可不计入，但须加以注明（具随体的染色体在表中以星号“*”标记）。所量数据填入下表：染色体序号照相长度（mm）长臂+短臂=全长臂比（长臂/短臂）暂编号正式号放大倍数的求法：在每一个已照相的细胞染色体中找一条平直的用测微尺在显微镜下量制片上这条染色体的实际长度，然后用下式算出。某染色体在放大照片上的长度（μm）放大率=————————————————————测微尺测量的实际长度（μm）2.同源染色体配对：其识别依据是随体的有无、形状及大小、臂比值、染色体长度是否相等等，配对需根据所测数据并结合目测进行。3.排列：各对同源染色体按一定原则排列，正式编上序号（填入上表）。排列的原则是：染色体长的在前，如两对染色体长度完全相等，则按短臂长度顺序排列，长者在前短者排后。随体染色体（简称SAT）和性染色体排在最后或单独另排。B染色体一般排在最后。如为二型核型（中国水仙、芦荟等），则长染色体按L1，2……顺序排列，短染色体群按S1，2……顺序排列，而不是全部染色体统一依顺序排列。如遇普通小麦等异源多倍体植物，则应按亲本的染色体组（A、B、D三组）分别排列，而不是全部染色体统一按顺序排列。4.剪贴：在绘图纸的上方正中贴上模式照片（一张有代表性的中期染色体的完整照片）。照片应注明放大倍数，最好在其上标出一个以微米为长度单位的标尺，以便于目测出染色体的实际大小。将与模式照片同一细胞的染色体剪下，按照已确定的同源关系和先后顺序，粘贴在绘图纸上，粘贴时应使各条染色体的着丝点处于同一水平线上，短臂朝上，长臂朝下，贴好后即为该细胞的核型图并进行翻柏，供发表文章用。其它几个细胞的染色体，也进行排列剪贴，但不需翻拍。（三）绘制核型模式图1.换算出5个细胞同源染色体（臂）的实际长度平均值先求出每个细胞放大照片上各对染色体全长（臂长）的平均值（单位：mm），然后再算出5个细胞同号染色体的长臂、短臂、全长的平均值。将此值除以放大倍数，即得染色体（臂）实际长度（单位：微米），填入下表：染色体序号照相长度（mm）长臂+短臂=全长实际长度（μm）长臂+短臂=全长2.求出相对长度、臂比、确定染色体类型填表并写出核型公式。相对长度的计算公式为：某染色体（臂）的长度相对长度（%）=———————————————×100%染色体组内各染色体的总长度相对长度的计算十分必要,因为它是稳定的可比较的数值,不象绝对长度那样易受预处理条件的影响。以实际长度求出臂比值，臂比反映的是着丝点在染色体上的位置，据此可确定染色体所属形态类型。见下表：臂比值着丝点位置简写正中部着丝点M—中部着丝点m近中部着丝点Sm—近端部着丝点St端部着丝点区t∞端部着丝点T填表，并写出核型公式，将核型的主要特征以公式表示，它简明扼要，便于记忆和比较，如紫花苜蓿为2n=4x=32=32m，蒙古冰草为2n=14=12m+2Sm，披碱草为2n=42=32m（4SAT）+10Sm（2SAT）。xxx染色体相对长度、臂比和类型染色体序号实际长度（μm）长臂+短臂=全长相对长度（%）长臂+短臂=全长臂比（长/短）类型核型公式：2n=3.绘制核型模式图：以表中所列各染色体的相对长度平均值进行绘图。先在坐标纸上绘好，再将其描在硫酸纸上，横座标为染色体序号，纵座标为相对长度（%），着丝点位于纵座标0处，短臂向上，长臂向下。（四）综合描述：内容为：染色体总数、大小、所含染色体组的数目及来源（同原或异源）；每个染色体组的染色体基数、组型的对称性等。Stebbins（1971）根据核型中染色体的长度比、两臂比两项主要特征，用以区分核型的对称和不对称程度，并将其分为12种类型，可作为核型表述的一个内容，1A为最对称的核型，4C为最不对称的核型。最长/最短臂比大于2：1的染色体的百分比——＜2：11A2A3A4A2：1—4：11B2B3B4B＞4：11C2C3C4C染色体大小的划分，根据1980年Limade—Faria提出的标准：实验长度1μm以下的为极小染色体；1—4μm为小染色体；4—12μm为中等染色体；12—60μm为大染色体。根据上述标准对蒙古冰草（或紫花苜蓿）的全套染色体进行描述。几点说明：1.关于具小染色体植物的核型分析对于染色体长度在2微米以下，不易分辨着丝点的染色体，可从以下几方面进行核型的分析和比较：（1）染色体数目；（2）具随体的染色体数目（如可见的话）；（3）每对染色体的相对长度值；（4）染色体长度比：（5）如含有大小差别明显的染色体，可分大、小类群分别统计其数量和长度，以及各自所占染色体组全长的百分比。2.作核型分析的材料若不是常见物种，则应有全株植物相片及标本。3.若对染色体标本进行分带处理，则在核型分析时应包括带型分析内容。四、作业绘制、填写蒙古冰草（或紫花苜蓿）的染色体核型图，核型分析表和核型模式图，并对蒙古冰草（或紫花苜蓿）染色体、组型进行综合描述。附：显微测微计的使用方法（一）显微测微计的结构和测量原理它由目镜测微计和镜台测微计二个部件组成。前者为一块可放在目镜内的圆形玻片，其中央刻有5大格，每格又分为10小格共50等分的小格（常用的一种）。镜台测微计为一特制的载玻片，其中央胶粘一圆形玻片，刻有尺度，一般为1mm，分10大格，每格为10小格，共100等分的小格，每小格等于10μm。目镜测微计每小格的长度，随目镜、物镜放大倍数的大小而变动。因此，必须先以镜台测微计来校准并计算出在某一物镜下接目测微计每小格的长度，然后才能用接目测微计来测量被测对象的长度和宽度。也就是说二者必须配合使用，才能完成其测量过程。（二）使用方法1.放置目镜测微计：取出目镜，旋开接目透镜，将目镜测微计放在目镜的光阑上（有刻度一面向下），然后旋上接目透镜，插上镜筒（注意：研究用显微镜的目镜结构精密，不允许随便拆卸，要使用本身带有测微计的目镜）。2.放置镜台测微计：将镜台测微计放在载物台上，通过调焦以便看清镜台测微计上的刻度。3.校准目镜测微计的长度用低倍物镜观察，移动镜台测微计和转动目镜测微计，使两者刻度平行，并使两者间某段的起、止线完全重合，数出两条重合线之间的格数，即可求出目镜测微计每格的相应长度。用同样的方法可分别测出用高倍物镜和油镜观察时目镜计每格的相对长度。4.目镜测微计每格长度的计算台尺重叠格数×10μm目镜测微计每小格长度=————————————目尺重叠格数举例：现测得显微镜的目镜测微计50格相当于镜台测微计8格，则目镜测微计每格长度为8×10μmμm。5.测量染色体长度：取下镜台测微计，将染色体制片放在镜台上，通过调焦，使细胞中的染色体在高倍镜下清晰可见，转动目镜测微计或移动载玻片，测量染色体长度，记下所占的格数，然后用目镜测微计每格长度乘以测得的格数，即为染色体实际长度值。用毕后取出目镜测微计，将接目镜放回镜筒，用擦镜纸将目镜测微计上的油腻和手印擦去。

实验十二植物染色体（Giemsa）分带技术一、实验目的植物染色体分带是70年代兴起的一项细胞学新技术，它借助且酶、碱、酸、盐、热等各种处理程序，再用Giemsa染料染色，使染色体特定部位呈现出深浅不同的带纹，可以更准确地鉴别单个染色体和染色体组。此项技术被应用于植物细胞学、细胞遗传学、植物分类学、染色体工程学、农作物遗传育种等基础理论和应用科学方面的研究中。本实验的目的是掌握植物染色体Giemsa分带技术及染色体带型分析的方法。二、实验材料洋葱鳞茎（2n=16）,大麦（2n=14）、蚕豆（2n=12）、黑麦（2n=14）种子（以上材料任取一种即可）。三、实验器具和药品生物染色体冷冻机或液氮罐、1/1000天平、小台秤、温箱、恒温水浴、试剂瓶、容量瓶、量筒、烧杯、滴杯、滴瓶、染色缸、载片、盖片、显微镜、显微照相及冲洗放大设备、剪刀、镊子、刀片、铅笔、滤纸、牙签、玻璃板、切片盒。Giemsa母液、Sorensen磷酸缓冲液、2×SSC溶液、盐酸、甲醇、乙醇、冰醋酸、氢氧化钡、秋水仙碱、纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、1%醋酸洋红、45%醋酸等。（配制方法见本实验附录）四、实验步骤1.染色体标本制备：既可采用传统的压片法制备染色体标本，也可用去壁低渗法，这里仅用前一种方法。（1）材料培养：方法同实验十（2）前处理：可用实验十药物，也可用秋水仙素。洋葱根长1cm、蚕豆2—3cm时切下根浸入秋水仙溶液、大麦、黑麦可在根长1cm时进行整体处理，将材料放在培养皿内，将前处理液倒入。试验材料秋水仙素浓度（%）前处理时间（小时）洋葱4蚕豆3黑麦3大麦3（3）固定方法同实验十。（4）解离用酸或酶解离材料，不仅可使根尖组织软化，而且直接影响以后染色体的显带，因此对酸的浓度、温度、处理时间要严格控制。试验材料解离方法洋葱0.1NHCl60℃5—8分钟蚕豆先在45%冰醋酸中浸泡2—3小时（室温），然后在55℃的45%冰醋酸中保温15分钟，或0.1N的HCl60℃8分钟大麦、黑麦用1%的果胶酶和纤维素混合液处理2—℃HCl中处理5分钟（5）压片、冻片、揭片和脱色将根尖放在载片中央、切取分生组织部分，滴上一滴1%醋酸洋红（45%醋酸），用压片法制片后镜检，对染色体分散而完整的片子用液氮或置生物染色体冷冻机上冷冻后，将盖片揭开。为除去细胞质对染色体显带的影响，揭片后，在盖片和载片上加几滴新配制的甲醇一冰醋酸固定液，置酒精灯上短时加热2—3次。经染色的制片要进行染色体脱色处理，可将制片放入45%醋酸中（55℃左右）8—10分钟或滴45%醋酸于盖、载片上，再在酒精灯上加热，重复3—4次直至全部脱色为止。（6）脱水脱酸、空气干燥因Giemsa是一种复合染料，一遇酸红色染料会发生沉淀，使染色体染成兰绿色，而不能显带，所以必须将酸脱净。具体方法是：把染色体标本放入95%→100%→100%酒精中逐级脱水脱酸，每级10—15分钟，然后将制片置室温下凉干。空气干燥需在无尘条件下进行，洋葱对空气干燥的时间要求较严，未经空气干燥的染色体标本显带，干燥一周后经显带处理能显示末端带，干燥半个月后同时显示末端带与着丝点带，干燥一个月后只能显示着丝点带，蚕豆、黑麦、大麦则对空气干燥的要求不十分严格。不同的显带方法所需空气干燥的时间也不一样，请参考下表：材料空气干燥时间BSG法HSG法黑麦24小时—15天12小时—7天大麦4—7天48小时—7天洋葱3天以上5天—2个月蚕豆1天—5小时—72小时2.显带处理空气干燥后的染色标本即可进行显带处理。（1）BSG法（Ba(OH)2—2×SSC—Giemsa）是当前广泛用于植物染色体GiemsaC-带方法。将干燥后的蚕豆染色体片子用5%氢氧化钡饱和水溶液在18—25℃下处理5分钟(黑麦5分钟、大麦60—80分钟)，蒸馏水彻底冲洗，2×SSC（0.3MNaOH6H5Na3O7·2H2O）溶液65℃保温两小时（黑麦、大麦在60℃下，分别处理45—60分钟和30—40分钟）。再用蒸馏水冲洗，稍干后以5%Giemsa溶液染色20—30分钟，冲洗掉片上多余的染料（用蒸馏水），空气干燥，树胶封片。（2）HSG法（盐酸—盐Giemsa）显示C带。—90分钟（黑麦处理10分钟、大麦60分钟、蚕豆70分钟），蒸馏水冲洗。2×SSC溶液中保温（60—66℃）15分钟（蚕豆在此温度下处理30—50分钟、大麦60℃下30—40分钟、黑麦60℃下30—35），蒸馏水冲洗，10%Giemsa溶液（磷酸缓冲液稀释原液）染色10分钟左右，蒸馏水冲洗，空气干燥，树胶封片。（3）胰酶-Giemsa法显示C带将空气干燥后的蚕豆染色体片子放在0.05％胰酶溶液中（pH7.2），在34℃下温育15—30分钟，及时冲洗掉酶液，用10％Giemsa（pH7.2）染色10—15分钟，蒸馏水冲洗，空气干燥，树胶封片。（4）NaH2PO4法对核仁组织区显带十分明显，称为N带。将空气干燥后的大麦染色体片子在1MNaH2PO4溶液中94℃±1℃温浴3—5分钟，蒸馏水冲洗，5%Giemsa（pH7.2）染色半小时，水冲洗，空气干燥，树胶封片。注意事项及说明①掌握好碱、酶、酸处理时间和温度是显带的关键所在。不同材料处理时间不同，变性过头会破坏染色体破坏，变性处理不足，染色体则不显带或带纹很浅。②应用BSG法显带在Ba(OH)2处理后必须用蒸馏水彻底冲洗以清除Ba(OH)2，如果冲洗不净，即使有微量的Ba(OH)2存在，都会对以后的分带造成不良的影响。③染色时，取配好的Giemsa母液，以Sorenson磷酸缓冲液按一定比例稀释，BSG法中多用pH6.8缓冲液稀释，,HSG法中则用pH7.2缓冲液稀释，为防止染料沉淀在载片上，染色时将有材料的面朝下，放在玻璃板上，中间垫上牙签，用滴管将染液从旁边滴进去。3.带型分析及说明说明：Giemsa显带在植物上主要产生C带，所谓C带，本意是着丝点带或组成型异染色质带的意思，但在植物染色体上除着丝点及其附近显带外，在染色体两臂的端粒部及端粒与着丝点之间都可以显带，并因植物种类不同而异，现分述如下：（1）着丝粒带（Centromericband），是指着丝粒及其附近的带，大部分植物均有这种带型。上述的材料中仅洋葱带型较浅。（2）中间带（Intercalaryband），指分布于染色体着丝粒至末端之间的带，小麦B组染色体中间带较多且明显，蚕豆染色体中间带一般在长臂上。（3）末端带（Telomericband），位于染色体末端的带，洋葱有较明显的末端带，小麦仅部分染色体显示，大麦、蚕豆则不显示。（4）核仁缢痕带（Nucleolaronstrictionband），是指核仁染色体特殊的带型，位于核仁组织中心区。蚕豆、玉米、大麦、小麦均有明显的核仁缢痕带。C带分类方法常用带名称英文的头一个字母为代表，记录植物C带的显带情况，分为下列二种类型：①完全带类型:处理染色后,同时出现四种带类型称为完全带,用字母ClTN表示,黑麦染色体C带属于这一类型。②不完全带类型：只显示三种以下的带类型，具体可再分为4种亚类：a.ClN型：缺乏末端带类型，大麦、小麦和蚕豆的染色体。b.CTN型：不具有中间带类型，如洋葱。c.TN型：只有末端带和缢痕带，如玉米等。d.N型：只有缢痕带。除着丝粒带之外，对于具双臂的染色体还有一个带分布在哪一个臂上的问题。如带在短臂上，把“＋”号写在字母右上角，如带在长臂上，则把“＋”号写在字母的右下角；再者，如若干条染色体具有同类带型，则在字母符号前放一系数，而不显带的染色体仅用数字表示。如：蚕豆为2n=12=ClN型=

2Cl＋＋8Cl＋+2ClN，意思是说，有一对同源染色体具着丝粒带和短臂上中间带，4对同源染色体具着丝粒带和长臂上中间带，另一对同源染色体具着丝粒带、两臂的中间带和缢痕带。玉米2n=20=TN型=6T＋＋2T＋＋2N＋10，这里10表示有5对同源染色体不显带。带型分析：首先必须有整个染色体组的带型照片，每对染色体带纹详细说明，最后绘制出带型模式图，具体操作步骤如下：①选择染色体数目完整，长度合适，分带清晰的材料进行显微摄影，冲洗放大后进行染色体剪贴（方法同组型分析）。②详细记录每条染色体上带纹的位置、宽窄、染色深浅和形状等。③绘制染色体模式图，然后在各条染色体模式图上标出各条带纹的位置、宽窄、深浅、形状等线条。五、作业1.制备一张质量较好的分带片。2.如实验未能得到预期的结果，请分析原因。附录：（一）药品配制1.2×SSC溶液（0.3MNaCl＋0.3M柠蒙酸钠）称取Nagg，置于容量瓶中加水至1000ml。3.当量盐酸的配制：（实验十附录）4.磷酸缓冲液（Sorensen配方）2PO4置于容量瓶内，加蒸馏水至1000ml。2PO4置于容量瓶内，加蒸馏水至1000ml。使用时根据pH值的要求按下列比例混合：pH值A液（ml）B液（ml）5.Giemsa染色液：100ml磷酸缓冲液加上3—5mlGiemsa母液。此液必须在临用前配制。（二）SSG（碳酸氢钠/盐/吉母萨）法显示C带。此法的优点：NaHCO3很易溶于水，用它来替代Ba(OH)2制片清洗方便，而Ba(OH)2很难洗净，易产生钡膜污染，影响分带。NaHCO3的碱性比Ba(OH)2弱，对染色体破坏小。处理条件为：45%醋酸洋红压片。制片空气干燥约4—16天。制片放入5%NaHCO3溶液（pH8.9）中，17—26℃下处理10—30分钟。2×SSC，60—66℃处理50—80分钟，用pH6.8磷酸缓冲液配制的10:1Giemsa染液染色10—15分钟，封片，观察，照相。（三）BSHG（氢氧化钡/盐/盐酸/吉姆萨）法显示C带流程大体流程：碱→盐→酸，材料：玉米、蚕豆、洋葱等。处理条件：饱和Ba(OH)245℃处理50分钟，然后用40℃的去离子水充分冲洗，风干。盐（2×SSC）处理温度为60℃，时间因植物而异，玉米55分钟，蚕豆洋葱20分钟左右。处理后的制片用去离子水冲洗，风干。酸（0.2NHCl）处理为25℃，时间为1小时，自来水冲洗，风干。

实验十三培养基母液配制一、实验目的和要求（一）掌握培养基母液的配制方法为保证配制培养基的精确性和方便起见，常在配制前将大量元素、微量元素、铁盐、氨基酸、维生素、激素类分别配制成母液，配制培养基时，只需吸取一定量的母液即可。（二）配培养基时操作应认真，称量务须精确，最好由两人校正，以防发生差错。二、实验器材及药品（一）器材：分析天平（感量0.001克）、扭力天平（感量0.01克）、台平（0.5克）、烧杯（50ml、100ml）、量筒（1000ml、500ml、250ml）、容量瓶（100ml、50ml）、细口瓶（1000ml、500ml、250ml）、滴瓶（100或150ml）、玻璃棒、药勺等。（二）药品：按培养基配方准备，并尽可能采用分析纯。三、配制方法以MS培养基配方（1962）为例（见下表），说明其配制方法，母液配制必须用重蒸馏水。（一）大量元素母液的配制用感量为0.01克的扭力天平，把无机盐中大量元素按培养基配方的10倍分别称量，置50ml小烧杯中，每杯倒入约30—40ml重蒸馏水、分别溶解后（为增快溶解速度，可在酒精炉上以60—70℃的温度稍加热），顺次混合定容于1000量筒中，注意氯化钙必须最后加入，因为钙离子（Ca2+）与磷酸根离子（PO43-）、硫酸根离子（SO42-）会产生出不溶于水的磷酸钙、硫酸钙沉定。将配好的混合液倒入细口瓶中，贴上标签，置冰箱中存放，配制增养基时，每配1000ml取此液100ml。（二）微量元素母液的配制用感量为0.001的分析天平，把无机盐中的微量元素按培养基配方的100倍分别称量，置50ml烧杯中，分别溶解后，再混合定容于1000ml量筒中，将混合液倒入细口瓶中，贴上标签，存放于冰箱中。配制培养基时，每配1000ml取此液10ml。（三）铁盐母液的配制目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，这种螯合物使用方便，比较稳定，其配法：用感量为0.01克的扭力天平取硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）5.56克，乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）克，分别溶解后混