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第四章

发酵与酿造工程学基础及主要设备发酵与酿造工程学基础及主要设备第1页

第一节发酵与酿造工艺过程发酵与酿造工程学基础及主要设备第2页一、菌种活化与扩大培养

发酵与酿造工程学基础及主要设备第3页

种子扩大培养是指将保留在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐层扩大培养,最终取得一定数量和质量纯种过程。这些纯种培养物称为种子。种子扩大培养概念:种子扩大培养目标与要求发酵与酿造工程学基础及主要设备第4页发酵与酿造工程学基础及主要设备第5页种子扩培目标

接种量需要

菌种驯化

缩短发酵时间、确保生产水平种子要求：

总量及浓度能满足要求

生理情况稳定，个体与群体

活力强，移种至发酵后，能够快速生长

无杂菌污染发酵与酿造工程学基础及主要设备第6页（一）种子制备技术概要1.种子制备过程试验室阶段：不用种子罐，所用设备为培养箱、摇床等试验室常见设备，在工厂这些培养过程普通都在菌种室完成，所以现象地将这些培养过程称为试验室阶段种子培养。生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，普通在工程归为发酵车间管理，所以形象地称这些培养过程为生产车间阶段。发酵与酿造工程学基础及主要设备第7页2.试验室阶段

接入斜面/平板，培养成熟后，挑选孢子，再一次接入斜面/平板，进行活化。(两次转接)A、砂土管或冷冻干燥管菌种活化发酵与酿造工程学基础及主要设备第8页

可采取固体培养基培养孢子，直接作为种子罐种子。

举例:产黄青霉菌，采取大米或小米为固体培养基，装入摇瓶、灭菌，耍注意控制米粒含水量，使米粒不粘不散。接入孢子，25-28℃培养14d。培养结束，将孢子瓶于真空下抽去水分，使含水量10％以下，冰箱保留备用。B、产孢子能力强及孢子发芽、生长繁殖快菌种发酵与酿造工程学基础及主要设备第9页

能够用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡培养，取得菌丝体，作为种子。比如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。C、产孢子能力不强或孢子发芽慢菌种发酵与酿造工程学基础及主要设备第10页

生产上普通采取斜面营养细胞保藏法。斜面菌种于32℃，培养18-24h，即可移入250mL摇瓶液体培养基，32℃培养12h，即可作种子罐种子。

比如：谷氨酸棒状杆菌。D、不产孢子细菌发酵与酿造工程学基础及主要设备第11页

普通保留在麦芽汁琼脂培养基或MYPG培养基斜面上，4℃冰箱保留.每年移种3-4次。斜面菌种→接入含10mL麦芽汁试管→25-27℃培养2-3d→扩大至三角瓶→25℃培养2d→移至含5-10L麦芽汁罐→15-20℃培养3-5d→含100L麦芽汁发酵罐。E、生产啤酒酵母菌MYPG培养基：3g麦芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨,10g葡萄糖,20g琼脂,1L水。发酵与酿造工程学基础及主要设备第12页3.生产车间阶段

采取易被菌利用成份，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐等，同时还需供给足够无菌空气并不停搅拌，使菌丝体在培养液中均匀分布，取得相同培养条件。种子罐培养标准：发酵与酿造工程学基础及主要设备第13页摇瓶菌丝体种子：种子罐之间或发酵罐间移种：接种方法：可在火焰保护下接入种子罐或采取压差法接入。主要采取压差法，由种子接种管道进行移种，移种过程中要预防接收罐表压降至零。发酵与酿造工程学基础及主要设备第14页生产车间种子制备工艺可控参数:种子罐级数种龄接种量发酵与酿造工程学基础及主要设备第15页A种子罐级数确定种子罐级数指制备种子需扩大培养次数.种子罐级数意义：

种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可降低移种带来染菌机会。但也必须考虑尽可能延长发酵罐生产产物时间，缩短因为种子发芽、生长而占用非生产时间，以提升发酵罐生产率。所以，种子罐级数不宜过少。发酵与酿造工程学基础及主要设备第16页

种子罐级数随菌种及规模而定，也与工艺条件相关。优化种子罐培养条件，加速孢子发芽及菌体繁殖，也可降低种子罐级数。发酵与酿造工程学基础及主要设备第17页（1）生长快细菌，种子用量少，种子罐对应也少。

比如：谷氨酸生产中，菌接入种子罐32℃培养7一10h，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。发酵与酿造工程学基础及主要设备第18页（2）生长较慢菌种，种子用量大，种子罐对应也多。

比如：青霉素孢子悬液接入一级种子罐（发芽罐）于27℃培养40h，孢子发芽，长出短菌丝。再移至第二级种子罐（繁殖罐），27℃培养10-24h，菌丝快速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。普通50m3发酵罐都采取三级发酵。

发酵与酿造工程学基础及主要设备第19页（3）生长更慢菌种

链霉素生产菌种灰色链霉菌，普通采取三级种子罐扩大培养。在小型发酵罐(5-30L)进行试验时，也有采取直接孢子或菌丝体接入罐中发酵，称一级发酵。发酵与酿造工程学基础及主要设备第20页

接种龄是指种子罐中培养菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时培养时间。接种龄以菌丝处于对数生长久，且培养液中菌体量还未到达最高峰时，较为适当。

过于年轻种子：前期生长迟缓、发酵周期延长、产物形成推迟，甚至会因菌丝量过少而在发酵罐内结球，造成异常发酵情况。

过老种子：会引发生产能力下降，菌丝过早自溶。

不一样品种或同一品种工艺条件不一样，接种龄是不一样，要经试验，确定最适接种龄。B接种龄发酵与酿造工程学基础及主要设备第21页

移入种子液体积和接种后培养液体积百分比。接种量大小决定于菌种在发酵罐中生长繁殖速度。

比如：抗生素发酵最适接种量为7-15％，有时可增加到20-25％。而谷氨酸发酵只需1％。C.接种量发酵与酿造工程学基础及主要设备第22页大接种量：能够缩短发酵罐中菌丝繁殖抵达高峰时间，使产物形成提前，且生产菌快速繁殖，可降低杂菌生长机会。

原因：??(a、种子量多b、种子液含大量水解酶类，利于利用基质)接种量过多：

往往使菌丝生长过快、培养液粘度增加，造成溶解氧不足，而影响产物合成。发酵与酿造工程学基础及主要设备第23页嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶：1％接种量产酶活力最高，超出4％酶产量显著下降。发酵与酿造工程学基础及主要设备第24页接种量过小：

除了延长发酵周期外，往往还会引发其它不正常情况。

比如：在头孢菌素生产中，因为接种量过小，会产生大量菌丝团，而使产量降低，

但有抗生素如制霉菌素，用1％接种量比用10％接种量效果好，而0.1％接种量与1％效果相同。发酵与酿造工程学基础及主要设备第25页

近年来，生产上多以加大种子量及采取丰富培养基作为取得高产办法。

双种法：有产品采取二只种子罐接一只发酵罐，如卡那霉素生产中采取双种比单种发酵单位提升8％，而且到达产量高峰时间提前。

倒种法：即以适宜发酵液倒出适量，给另一发酵罐作种子．比如链霉素发酵中，使用倒种法比单种发酵单位提升12％。而四环素发酵采取双种效果并不显著。发酵与酿造工程学基础及主要设备第26页(1)原材料质量

生产过程中经常出现种子质量不稳定现象，其主要原因是原材料质量波动。(什么引发原料质量波动?)

A.影响种子质量原因

原材料质量波动，起主要作用是无机离子含量不一样，如微量元素镁、铜、钡能刺激孢子形成。磷含量太多或太少也会影响孢子质量。

4.种子质量控制发酵与酿造工程学基础及主要设备第27页例1：四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量不一样对孢子质量影响也不一样。例2：制备霉菌用大(小)米，其产地、颗粒大小、均匀程度不一样，孢子质量也不一样。

例3：蛋白胨加工原料不一样，对孢子影响也不一样。

例4：琼脂牌号不一样，其中含无机离子差异而引发孢子质量改变。

例5：水质硬度、污染程度对生产都有影响。发酵与酿造工程学基础及主要设备第28页

(2)培养条件

①温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响。

比如：土霉素生产菌种在高于37℃培养时，孢子接入发酵罐后，表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。发酵与酿造工程学基础及主要设备第29页②湿度斜面培养基湿度对孢子数量和质量有较大影响。

比如：土霉素生产菌种龟裂链霉菌孢子制备时发觉：北方气候干燥地域孢子斜面长得较快，在含少许水分试管斜面下部孢子长得很好，而斜面上部因为水分快速蒸发呈干瘪状，孢子稀少。在气温高湿度大地域，斜面孢子长得慢，主要因为试管下部冷凝水多而不利于孢子形成。发酵与酿造工程学基础及主要设备第30页③通气量

种子罐有足够通气量能够提升种子质量。

比如:

青霉素生产，将通气充分和不足情况下得到种子分别接入发酵罐，发酵单位相差1倍。

但也有例外

比如：土霉素生产中，一级种子罐通气量小对发酵有利。发酵与酿造工程学基础及主要设备第31页(3)斜面冷藏时间

比如：土霉素生产菌种，孢子斜面培养4d即于4℃冰箱保留，冷藏7-8d菌体细胞开始自溶。而培养5d以后冷藏，20d未发觉自溶。

比如：链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两个月后发酵单位比冷藏一个月降低18％。斜面冷藏对孢子质量影响与孢子成熟程度相关。冷藏时间对孢子生产能力也有影响。发酵与酿造工程学基础及主要设备第32页为确保种子质量，除确保培养条件外，还要定时取样测定一些参数，以观察基质代谢改变及菌丝形态是否正常。

1).pH2).培养基灭菌后磷、糖、氨基氮含量3).菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗粒等)4).其它参数，如接种前抗生素含量、某种酶活力等B.种子质量判断测定参数:发酵与酿造工程学基础及主要设备第33页用酶活力来判断种子质量是一个新尝试：

比如：土霉素发酵中，种子液淀粉酶活力与发酵单位有一定关系。淀粉酶活力高，接入发酵罐后土霉素发酵单位也高，反之则低。发酵与酿造工程学基础及主要设备第34页（1）菌种稳定性检验生产菌种，必须保持稳定生产能力，即使菌种保藏在休眠状态环境中，但微生物或多或少会出现变异危险，所以定时考查及挑选稳定菌种十分主要。方法：取少许菌种，逐层稀释，划线培养。挑出形态整齐、孢子丰满菌落，摇瓶试验，测定生产能力。C.种子质量控制发酵与酿造工程学基础及主要设备第35页（2）无(杂)菌检验

种子制备过程中，每移种一步，均需进行杂菌检验。

方法：镜检、肉汤或平板培养、种子液生化分析。

生化分析项目：营养消耗速度、pH改变、溶氧利用情况、色泽、气味有否异常等。发酵与酿造工程学基础及主要设备第36页（二）种子制备过程举例1.谷氨酸生产种子制备制备过程斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵发酵与酿造工程学基础及主要设备第37页（1）斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5

琼脂2%，pH7.0-7.2培养基特点：有利于菌体生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-二十四小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超出3次发酵与酿造工程学基础及主要设备第38页（2）一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，K2HPO40.1%培养基特点：有利于菌体生长，所使用原料已经基本靠近于发酵培养基发酵与酿造工程学基础及主要设备第39页（3）二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐1%(10%)），32℃培养7-10个小时培养基：和一级种子相同，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基特点：长菌体，更靠近于发酵培养基发酵与酿造工程学基础及主要设备第40页种子质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛发酵与酿造工程学基础及主要设备第41页2.青霉素生产种子制备制备过程安培管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵发酵与酿造工程学基础及主要设备第42页（1）斜面孢子培养基：甘油、葡萄糖、蛋白胨等培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细培养条件：25℃、7天,注意湿度50%左右发酵与酿造工程学基础及主要设备第43页（2）大米孢子培养基：大米及氮源（玉米浆）培养基特点：成本低、米粒之间结构疏松提升比表面积和氧传质，营养适当（要求大米白点小）有利于孢子生长。培养条件：25℃、7天，控制湿度大米孢子要求：1粒米含1.4*10个孢子发酵与酿造工程学基础及主要设备第44页（3）一级种子培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆目：长菌体培养条件：27℃，40小时接种量：200亿孢子/吨（4）二级种子培养基：同上培养条件：27℃、10-14小时接种量：10%发酵与酿造工程学基础及主要设备第45页种子质量要求菌丝长稠呈丝状、菌丝团极少。青霉素发酵菌丝体生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素能力最强发酵与酿造工程学基础及主要设备第46页二、发酵与酿造原料前处理及

培养基制备发酵与酿造工程学基础及主要设备第47页培养基：广义上讲培养基是指一切可供微生物细胞生长繁殖所需一组营养物质和原料。同时培养基也为微生物培养提供除营养外其它所必须条件。

发酵培养基作用：

满足菌体生长促进产物形成发酵与酿造工程学基础及主要设备第48页发酵培养基要求①培养基能够满足产物最经济合成。②发酵后所形成副产物尽可能少。③培养基原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储备，能确保生产上供给。④所选取培养基应能满足总体工艺要求，如不应该影响通气、提取、纯化及废物处理等。发酵与酿造工程学基础及主要设备第49页（一）培养基类型及功效培养基按其组成物质纯度、状态、用途可分为三大类型

1.按纯度

合成培养基

:原料其化学成份明确、稳定

适合于研究菌种基本代谢和过程物质改变规律

培养基营养单一，价格较高，不适适用于大规模工业生产

天然培养基:采取天然原料

原料起源丰富(大多为农副产品)、价格低廉、适于工业化生产

原料质量等方面不加控制会影响生产稳定性

发酵与酿造工程学基础及主要设备第50页M培养基(1L)：Na2HPO46g，KH2PO43g，NaCl0.5g，NH4Cl1g，MgSO4.7H2O0.5g，CaCl20.011g，葡萄糖2-10,pH7.0YPS培养基：酪蛋白胨（日本大五营养）10g，酵母提取物（英国Oxoid）5g,NaCl10g，PH7.2培养大肠杆菌惯用两种培养基发酵与酿造工程学基础及主要设备第51页2.按状态固体培养基

:适合于菌种和孢子培养和保留，也广泛应用于有子实体真菌类，如香菇、白木耳等生产

半固体培养基:即在配好液体培养基中加入少许琼脂，普通用量为0.5%～0.8%,主要用于微生物判定。

液体培养基:80%～90%是水，其中配有可溶性或不溶性营养成份，是发酵工业大规模使用培养基。3.按用途（从发酵生产应用考虑）

培养基按其用途可分为孢子（斜面）培养基、种子培养基和发酵培养基三种

发酵与酿造工程学基础及主要设备第52页（二）发酵培养基成份及起源

1.碳源（1）作用提供微生物菌种生长繁殖所需能源和合成菌体所必需碳成份

提供合成目标产物所必须碳成份（2）起源糖类、油脂、有机酸、正烷烃发酵与酿造工程学基础及主要设备第53页（3）工业上惯用糖类①葡萄糖

全部微生物都能利用葡萄糖不过会引发葡萄糖效应

工业上惯用淀粉水解糖，不过糖液必须到达一定质量指标发酵与酿造工程学基础及主要设备第54页②糖蜜糖蜜是制糖生产时结晶母液，它是制糖工业副产物。

糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。普通糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。发酵与酿造工程学基础及主要设备第55页糖蜜使用注意点：除糖份外，含有较多杂质，其中有些是有用，不过许多都会对发酵产生不利影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物质：胶体成份（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（造成异柠檬酸生成）预处理：→黄血盐发酵与酿造工程学基础及主要设备第56页③淀粉、糊精使用条件：微生物必须能分泌水解淀粉、糊精酶类缺点：难利用、发酵液比较稠、普通>2.0%时加入一定α-淀粉酶成份比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：起源广泛、价格低难利用，能够解除葡萄糖效应发酵与酿造工程学基础及主要设备第57页例：地衣牙孢杆菌生产α-淀粉酶碳源对生长和产酶影响碳源细胞量α-淀粉酶葡萄糖4.20蔗糖4.020糊精3.0638.2淀粉3.0940.2发酵与酿造工程学基础及主要设备第58页2.氮源

氮源主要用于组成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。惯用氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。

（1）无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水特点：微生物对它们吸收快，所以也称之为快速利用氮源。但无机氮源快速利用常会引发pH改变如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH

发酵与酿造工程学基础及主要设备第59页

无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调整发酵过程pH有主动作用。所以选择适当无机氮源有两层意义：

满足菌体生长稳定和调整发酵过程中pH发酵与酿造工程学基础及主要设备第60页（2）有机氮源起源：工业上惯用有机氮源都是一些廉价原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。成份复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量无机盐及生长因子。例玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多乳酸③硫、磷、微量元素等发酵与酿造工程学基础及主要设备第61页有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而其次有机氮源来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料波动对发酵影响发酵与酿造工程学基础及主要设备第62页氮源使用一些相关问题：

有机氮源和无机氮源应该混合使用早期：轻易利用易同化氮源—无机氮源中期：菌体代谢酶系已形成、则利用蛋白质

有些产物会受氮源诱导和阻遏例：蛋白酶生产

有机氮源选取时也要考虑微生物同化能力

开发效果好、有针对性有机氮源依然是令人感兴趣课题发酵与酿造工程学基础及主要设备第63页3.无机盐微量元素作用：各种不一样起源：C、N源，以盐形式补充用量：依据详细产品，以试验决定使用注意点：发酵与酿造工程学基础及主要设备第64页例：铁离子青霉素发酵中，铁离子浓度要小于20μg/ml

发酵罐必须进行表面处理B、使用时注意盐形式（pH改变）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，pH对酶活影响

pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟A.对于其它渠道有可能带入过多某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑发酵与酿造工程学基础及主要设备第65页

前体指一些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其本身结构并没有多大改变，不过产物产量却因加入前体而有较大提升。（2）前体青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136发酵与酿造工程学基础及主要设备第66页4.生长因子、前体和产物促进剂

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺乏微量有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

（1）生长因子

如以糖质原料为碳源谷氨酸生产菌均为生物素缺点型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵调控起到主要作用。

有机氮源是这些生长因子主要起源，多数有机氮源含有较多B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺乏生长因子发酵与酿造工程学基础及主要设备第67页作用：前体有利于提升产量和组份用量：前体用量能够按分子量衡算，详细使用有个转化率问题例：6000单位/ml青霉素G,需要多少苯乙酸青霉素＝6000*0.6（微克）＝36mg/ml

苯乙酸＝（36*136）/356=13.8mg/ml=1.38%实际使用时转化率在46-90%之间

发酵与酿造工程学基础及主要设备第68页使用方法：前体使用时普遍采取流加方法前体普通都有毒性，浓度过大对菌体生长不利苯乙酸，普通基础料中仅仅添加0.07%

前体相对价格较高，添加过多，轻易引发挥发和氧化，流加也有利于提升前体转化率发酵与酿造工程学基础及主要设备第69页（3）产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须营养物，又非前体，但加入后却能提升产量添加剂。发酵与酿造工程学基础及主要设备第70页5.水

对于发酵工厂来说，恒定水源是至关主要，因为在不一样水源中存在各种原因对微生物发酵代谢影响甚大。

水源质量主要考虑参数包含pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。对于酿造行业，水主要性不言而喻

对于常规发酵，可靠、持久，能提供大量成份一致清洁水。发酵与酿造工程学基础及主要设备第71页（三）最佳培养基确定

当前还不能完全从生化反应基本原理来推断和计算出适合某一菌种培养基配方，只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等基本理论，参考前人所使用较适合某一类菌种经验配方，再结合所用菌种和产品特征，采取摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定试验设计和试验方法选择出较为适合培养基。

发酵与酿造工程学基础及主要设备第72页1.培养基成份选择标准

菌种同化能力

代谢阻遏和诱导

适当C、N比

pH要求

发酵与酿造工程学基础及主要设备第73页（1）理论转化率与实际转化率

理论转化率是指理想状态下依据微生物代谢路径进行物料衡算，所得出转化率大小。

实际转化率是指实际发酵过程中转化率大小

怎样使实际转化率靠近于理论转化是发酵控制一个目标

2.成分含量确定发酵与酿造工程学基础及主要设备第74页例:

如在酒精生产中葡萄糖转化为酒精理论转化率计算以下∶

葡萄糖转化为酒精代谢总反应衡算式为∶

C6H12O6─→