木瓜蛋白酶提取试验方案

实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取，纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Q（papayaproteinaseQ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapainM）,其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH直为5.7（一般3〜9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55〜60c（一般10〜85c皆可），耐热性强，在90c时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸镂分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。硫酸镂分级沉淀法：硫酸镂沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。 盐析时溶液PH在木瓜蛋白酶等电点时（PI=8.75）则效果最好，盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸镂因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。木瓜蛋白酶活力测定：蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯乙酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍

留在溶液中，溶解于三氯乙酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力酶活力单位定义：在规定条件下，1min内酶水解酪蛋白释放出相当于1ug/ml酪氨酸在275nm波长处的吸收度为1个活力单位。以0.1mol/l盐酸溶液做空白，在275nm波长处测定空白溶液，待测定液，对照品溶液的吸光度。饱和硫酸镂溶解曲线：。 20 40 60 80 100温度七。 20 40 60 80 100温度七校钢

酸化

确氯E1 操作I(7014)^04热饱和济浦f合成打J产品(无氟钾肥》KC1图2二、实验材料与仪器：材料：未成熟的番木瓜，无水乙醇，0.05mol/L磷酸氢二钠；0.1mol/LHC1乙二胺四乙酸二钠固体；氢氧化钠固体，酪蛋白固体，半胱氨酸固体，氯化钠固体，三氯乙酸固体，硫酸俊粉末，乙酸钠固体，和冰乙酸溶液， EDTA仪器：高速组织捣碎机，水浴箱，精确pH计，紫外分光光度计，高速冷冻离心机，精密电子天平，低温冰箱。三、技术路线试剂配制材料准备打碎番木瓜,匀速轻微搅拌lh粗提多层纱布过滤.收集滤液离心第一次纯化乙I?提取法第二次纯化硫酸筱分级沉淀法（盐析法）生物学研究

的活性测定

I 蛋片质含量二定」者马斯亮蓝） 四、实验步骤实验前准备：所需试剂的配制以及考马斯亮蓝 G-250法测蛋白含量的预实验，确保试验方法的可行性。考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）:称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL95%S醇中（95叱醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸储水）再加入86%磷酸100mL倒入1000mL容量瓶加蒸储水定容至1000mL静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。标准蛋白质溶液(0.1mg/mL):准确称取牛血清蛋白0.01g用蒸储水溶解并稀释到100mL现配现用。酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸储水中，调节PH至9.0,溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA定容至250ml,转入棕色瓶中。500ml的2%(m/v)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH8.0)溶液：称取10g的碳酸氢钠和0.1871g的EDTA容于500ml蒸储水中，调节PH至8.0。500ml的1mmol/LEDTA(pH8.0)溶液：称取0.1871g的EDTAS于500ml蒸储水中，调节PK8.00酪蛋白溶液：称取酪蛋白0.6g加入0.05mol/L磷酸氢二钠溶液80mL(取1.433g磷酸氢二钠固体加80mL蒸储水即得溶液)，置沸水浴中煮30min,时时搅拌，冷却至室温。加1M盐酸调节PH至7.00.1。加蒸储水稀释到100mL用前配置。酶稀释液：A液称取半胱氨酸0.264g,氯化钠1.17g,加蒸储水25m皤解；B液称取乙二胺四乙酸二钠0.112g,加蒸储水10m皤解；合并A、B液，搅拌土匀匀,用4.0mol/L氢氧化钠溶液调节PHS到5.5,加蒸储水稀释至50mL。用前配置。三氯乙酸溶液：取三氯乙酸0.9g,力口乙酸钠1.495g和冰乙酸0.95mL,加水溶解并稀释至50mL木瓜蛋白酶提取粗酶液提取：①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为 2〜3mm根据果实大小的不同，每个果实可以5〜1舔刀口。②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。③收集10ml乳汁加入190ml蒸储水水，匀速轻柔搅拌1h,得浆液。④浆液用8层纱布进行过滤，将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。⑤收集上精液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液， -20C存取10ml酶原液（编号为酶液1）。粗酶液纯化：将粗液放入冰桶中，加入适量酶保护剂（ 0.04mol/L的半胱氨酸和0.004mol/L的EDTA,混匀后如下表加入试剂 。酶液+保硫酸镂硫酸镂酶?++冷无水护剂粉末（至粉末（至保护剂乙醇(ml)终浓度终浓度(ml)(65%)20%)(g)的40%)(ml)(g)酶70+10148.6调节原ph为液36.0,酶70+10置于20静置30min,离22静置30min，离取1ml9+118.64c静原冰桶心4000r/min,心4000r/min,酶液置过液4中30min，弃沉淀30min,取沉（酶夜淀，加10ml蒸液储水2),-20℃保存对过夜的酶液继续处理

酶?++硫酸镂硫酸镂保护剂粉末粉末(ml)(至终(至终浓度浓度20%)40%)(g)(ml)酶4c4000r/min取1ml9+1置2.5静置30min,2.7静置30min,取1ml透取酶原静离心30酶液冰离心离心酶液析液并液置min,取沉(酶桶4000r/min,4000r/min,(酶袋编号3过淀，分别加液中30min，弃沉30min，取沉液4),处酶液夜加10ml蒸3),淀淀，加入-20℃理6,储水-20℃10ml蒸储水保存-20℃保存保存酶编号酶?5,-20C保存透取酶原析液并液袋编号4处酶液理7,-20℃保存透析：8000-14000标号的透析袋处理：①取透析袋剪成适当长度的小段。 放入大体积的2%(m/v)碳酸氢钠和1mmol/LEDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟。②用蒸储水彻底漂洗透析袋。放在1mmol/LEDTA(pH8.0)中将之煮沸10分钟,③冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时起取用透析袋是必须戴手套，在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净。④系好透析袋的一端，从另一端注入酶液4、5,将透析袋放入蒸储水中，在摇床上震荡，时时换蒸储水。⑤直至向蒸储水中加入氯化钢溶液，无沉淀产生及透析除盐完成。取出蛋白质溶液。木瓜蛋白酶活性及总蛋白含量测定：酶活性的测量酪氨酸标准液和酶液处理酪氨酸标准液的制备：精密称取酪氨酸0.005g用0.1mol/L盐酸溶解并定容至100mL(此为50ug/ml的标准液)酶液的处理：取0.3ml酶液，加酶稀释液2.7ml,稀释至3mL操作待测液：准确量取酶液溶液各1.0mL,分别置于2支10mL带塞试管中，于50度水浴预热5分钟，准确加入50度预热的酪蛋白溶液5mL立即振摇，置50度水浴中，精确反应10min后，加三氯乙酸溶液5.0mL,振摇,于50度水浴中放置40min,用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A。空白对照液：再精确量取酶液1.0mL,置于10mL具塞试管中，于50度水浴预热5min,准确加入50度预热的蒸储水5ml,置50度水浴中，加入三氯乙酸溶液5mL振摇，于50度水浴中放置40min,用干燥滤纸过滤，滤液在2h内采用分光光度法以水为空白，在275nm的波长处测定吸光度A0。酪氨酸标准液：另取酪氨酸对照溶液，以蒸储水为空白，在 275nm的波长处测定吸光度An酶液(ml)50度预热的三氯乙酸(ml)吸光度待测液1.050度水域预热5min酪学白溶液5ml50度水浴10min5.0震摇,50度水浴40min过滤，滤液以水为对照在275nm测吸光值，A1A1.05.0A2空白对照液1.0蒸储水5ml5.0A0酪氨酸标准液取酪氨酸溶液，以蒸储水为空白，狈U定吸光度An酶活力单位定义为在测定条件下，每1min生成1仙g/mL酪氨酸所需的酶量公式：A A0 A A0 Wi11n1000酶活力（U/g）= An W210式中：W1—酪氨酸标准液每1mL中含酪氨酸的量，单位为微克（pg）；10一反应时间；11一测定总体积；n一待测液的稀释倍数；1000一毫克与克的转换倍数。在上述条件下，每分钟水解酪蛋白生成1仙g酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位。酶含量的测量：取8支15mL试管，按下表加入试剂管号12345678蛋白质标准溶液（ml）00.10.20.30.40.60.81.O蒸储水（ml）1.00.90.80.70.60.40.20考马斯亮蓝（ml）4.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白质含量（ug）0102030406080100A595将试管摇匀，放置2-3分钟。用分光光度计比色测定吸光值 A