连续性血液净化对脓毒症患者单核细胞人类白细胞抗原DR表

连续性血液净化对脓毒症患者单核细胞人类白细胞抗原DR表达及预后的影响付素珍马骏孙杰董云赵琪关炳星【摘要】目的探讨应用连续性血液净化（CBP）后，严重脓毒症患者外周血单核细胞人类白细胞抗原DR（HLA-DR）表达水平变化及预后情况。方法将102例严重脓毒血症患者分为CBP组（60例）和常规治疗组（42例），在相同的常规治疗基础上，CBP组加用CBP治疗，至少持续治疗120h。于治疗前后比较两组患者急性生理学与慢性健康状况评分系统（APACHE）II评分和序贯器官功能衰竭（SOFA）评分；并记录两组患者28d生存率和重症医学科病房（ICU）住院时间。应用流式细胞仪检测治疗前及治疗后24h、72h、120h各时间点血浆T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及单核细胞HLA-DR表达。结果两组患者治疗前APACHEII评分、SOFA评分、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及单核细胞HLA-DR水平的差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗后CBP组患者APACHEII评分、SOFA评分均下降（P<0.05）。两组患者28d生存率差异无统计学意义（P>0.05），但CBP组ICU住院时间短于常规治疗组（P<0.05）。治疗120h后，CBP组患者外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及HLA-DR表达水平较治疗前明显升高（P<0.05），与同期常规治疗组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论CBP能通过清除炎症介质，上调外周血单核细胞人类白细胞抗原DR表达，达到恢复机体促炎/抗炎平衡，从而改善严重脓毒血症患者的总体病情。【关键词】连续性血液净化；脓毒症；HLA-DR；预后；Continuousbioodpurificationonmonocytehumanleukocyteantigen-DRexpressionandPrognosisinpatientswithseveresepsisFUSuzhen，MAJun，SUNJie，DONGYun，ZHAOQi，GUANBingxing.DepartmentofIntensiveCareUnit，People’sHospitalofXinTaiCity，Hebei，054001China【Abstract】ObjectiveTocontinuousbioodpurification（CBP）ontheexpressionofmonocytehumanleukocyteantigen-DR(HLA-DR)andprognosisinpatientswithseveresepsis.MethodsHundred-twopatientswithseveresepsisweredividedintoCBPgroup(60cases)andcontrolgroup(42cases)randomly.Thepatientsinthecontrolgroupweretreatedwithconventionaltherapy，andthepatientsintheCBPgroupreceivedatleast120hofCBPtreatmentadditionly.Theacutephysiologyandchronichealthevaluation(APACHE)IIscore，Thesequentialorganfailureassessment(SOFA)score，the28-daysurvivalrateandintensivecareunit(ICU)lengthofstaywererecordedandcomparedmonocytesHLA-DRexpressionimmunophenotypeoflymphocyte(CD3+、CD4+、CD4+/CD8+)expressioninperipheralbloodmononuclearcells(PBMC)weremeasuredbeforeandat24,72,120hafterthetreatment.ResultsTherewerenosignificantdifferencesintheAPACHEIIandSOFAscore，thelevelofplasmaHLA-DR、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+betweenthetwogroupsbeforethetreatment(Р>0.05).AndtheAPACHEIIandSOFAscoredescreasedmarkedlyintheCBPgroupafterthetreatment(Р<0.05).TheICUlengthofstayintheCBPgroupwasalllonger(Р<0.05)，whilethe28-daysurvivalrateshowednosingnificantdifferencewhencomparedtothecontrols(91.6%vs.71.2%，Р>0.05).IntheCBPgroup，thelevelsCD3+、CD4+、CD4+/CD8+、HLA-DRwererisedapparentlyat120hafterthetreatment(Р<0.05)，andthoseindexeswerelowerthanthecontrolgroup(Р<0.05).ConclusionCBPcaneliminateinflammatorymediators，risetheexpressionofHLA-DRinPBMCandtherebybringpro-inflammatoryandanti-inflammatorystatesintobalanceinpatientswithservesepsis.【Keyworeds】Continuousbioodpurification；Sepsis；Monocytehumanleukocyteantigen-DR；Prognosis脓毒症(sepsis)是感染引起的全身性炎症反应综合征（SIRS），病情进一步发展可导致脓毒症休克、多器官功能障碍综合征（multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS）甚至死亡，脓毒症休克是重症医学科（ICU）患者死亡的主要原因[1]。国内的脓毒症死亡率高达45%-70%[2-3]，国外报道约为30%-50%[4-5]，机体在感染基础上的炎症反应失控和免疫功能紊乱是脓毒症发生和发展的中心环节[6]，连续性血液净化（Continuousbioodpurification，CBP）通过削弱血液循环中的促炎介质和抗炎介质两种物质的峰值浓度来降低炎症反应和纠正免疫麻痹状态，重建机体免疫内稳态，为脓毒症的治疗开辟新的途径[7]。但目前对CBP治疗脓毒症的机制尚未深入探讨。本研究通过观察CBP对严重脓毒症患者外周血单核细胞人类白细胞抗原DR（HLA-DR）表达水平及预后的影响初步探讨其可能的治疗机制。1资料与方法1.1一般资料2008年3月至2014年2月本院ICU收治的102例严重脓毒症患者，其中男61例，女41例；年龄18-76岁；均符合2001年美国华盛顿国际脓毒症定义会议诊断标准[8]。排除标准：1）治疗不足5天患者；2）接受过免疫调节治疗者。原发病：严重创伤23例，重症肺炎30例，重症急性胰腺炎18例，急性化脓性腹膜炎11例，腹部闭合性损伤14例，大面积烧伤4例，肠系膜动脉栓塞2例。102例依据适应症、禁忌症、家属知情选择的不同，按治疗措施不同分为常规治疗组42例；CBP治疗组60例。两组患者年龄、性别、病种分布及危重程度等比较差异无统计学意义（P>0.05）。1.2方法1.2.1一般治疗两组患者均依据《2008年国际严重脓毒症和感染性休克指南》[9]及《拯救脓毒症运动（SSC）2012指南更新》[10]进行常规治疗，CBP组加用CBP治疗。1.2.2CBP治疗方法CBP组采用连续性静静脉血液滤过（CVVH）方法，治疗时间为120h。采用美国ARROW公司生产的12Fr双腔血管鞘管，颈内静脉或股静脉置管作为血管通路，使用FreseniusAV600S血滤器（聚砜膜，面积1.4m2），置换液采用美国百特医疗用品有限公司配配方（生理盐水3000ml，质量分数为5%的葡萄糖1000ml，质量分数为5%的碳酸氢钠250ml，质量分数为5%的氯化钙20ml，质量分数为25%硫酸镁3.2ml,质量分数为10%的氯化钾8-15ml，混合配制并装入一次性输液袋中），以前稀释方式输入，置换液流量为40ml/(kg.hr),血流速为200-250mL/min，置换液为前稀释法输入。设定温度置换液为为37℃。每24h更换1次滤器，出现凝血立即更换滤器。应用普通肝素抗凝，首次剂量1000-1500U,维持剂量10-15U/（kg.hr），严重出血倾向者，行无肝素治疗。1.3样本采集和观察指标所有患者治疗前及治疗后24h、72h、120h共采集静脉血5ml，测定CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、HLA-DR表达水平。记录实验室和生理指标以进行APACHEII评分和SOFA评分，并记录28d生存率和ICU住院时间。1.4标本检测外周血单核细胞HLA-DR的检测:先将异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD14抗体和藻红蛋白（PE）标记的抗HLA-DR抗体各20ul与100ul肝素化全血避光孵育20min，在加溶血剂100UL后避光混合20min；最后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，立即在流式细胞仪（Partec，德国）上进行HLA-DR的检测。单核细胞通过前向和侧向散射以及抗CD14抗体来选出，HLA-DR表达结果用表达HLA-DR的单核细胞百分数来表示。同样的方法检测CD3+、CD4+、CD8+、计算CD4+/CD8+。1.5统计学处理应用SPSS17.0软件包行统计学分析，所有数据采用均数±标准差（±s）表示，样本均数的比较用t检验，计数资料采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.128d转归情况及ICU住院时间常规治疗组和CBP组的28d生存率分别为71.2%（30/42）和91.6%（55/60），两组比较无统计学差异（P>0.05）。常规治疗组和CBP组的ICU住院时间分别为（11.8±4.1）和（9.4±4.4）天，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。2.2两组患者治疗前后APACHEII和SOFA评分的比较经治疗后，CBP组患者病情明显改善，APACHEII评分和SOFA）评分均下降（P<0.05），且分别与常规治疗组治疗后比较均有统计学差异（P<0.05）。但常规治疗组治疗前后比较无统计学意义（P>0.05），见表1。表1两组患者治疗前后APACHEII和SOFA评分的比较组别例数APACHEII评分（分）SOFA评分（分)常规治疗组治疗前4219.1±5.79.9±1.9治疗后4217.3±6.5a9.3±2.2aCBP组治疗前6019.7±5.19.2±2.4治疗后6011.9±4.1bc6.2±1.6bc注：与治疗前比较，aP>0.05；bP<0.05；与同期常规治疗组比较，cP<0.052.3两组患者治疗前后HLA-DR及T细胞亚群指标变化（%，±s）CBP组和常规治疗组在治疗前HLA-DR、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比较差异均无统计学意义（P>0.05）。治疗120h后，CBP组HLA-DR、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平较治疗前明显升高（P<0.05），且与同期常规治疗组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。常规治疗组上述指标也呈上升趋势，但治疗前后比较差异均无统计学意义（P>0.05），见表2。表2两组患者治疗前后HLA-DR、CD3+、CD4+、CD4+/CD8+变化（%，±s）组别时间HLA-DRCD3+CD4+CD4+/CD8+治疗前44.24±9.8950.92±5.4527.86±3.161.04±0.34常规治疗组治疗后24h50.30±5.7451.18±3.0728.26±1.181.05±0.29治疗后72h44.94±8.3147.79±3.4023.95±1.021.07±0.40治疗后120h50.15±1.4851.26±3.9327.15±2.841.09±0.22治疗前44.13±9.8749.17±5.1325.03±3.541.09±0.39CBP组治疗后24h60.31±3.1648.79±6.0725.42±1.341.55±0.19ab治疗后72h46.94±8.2848.79±6.0721.42±1.34b1.88±0.30ab治疗后120h55.90±6.99ab53.99±1.95ab29.18±1.96ab1.83±0.30ab注：与治疗前比较，aP>0.05；与同期常规治疗组比较，bP<0.053讨论脓毒症发病的本质是感染导致的过度炎症反应，机体促炎反应与抗炎反应的严重失衡以及免疫功能紊乱发挥了极其重要的作用[11-13]。Bone[14]研究发现，有相当比例的脓毒症患者存在免疫功能低下。即使炎症反应过度表达的患者，在其病程的不同阶段也可出现不同程度的免疫功能低下，甚至免疫麻痹，CD14+单核细胞HLA-DR表达下降被认为是脓毒症免疫抑制或免疫麻痹的重要标志[15-18]。Volk[19]等研究发现，CD14+单核细胞HLA-DR表达率<30%即可认为存在免疫抑制甚至免疫麻痹，并对预测预后有意义。多因素分析显示，HLA-DR水平降低可以作为预测脓毒症死亡的独立因素，并且较简化急性生理评分II（SPPAII）和SOFA更可靠[20]。本研究发现，HLA-DR>30%的患者，常规治疗组与CBP组患者28d生存率分别为71.2%（30/42）和91.6%（55/60），两组比较无统计学差异（P>0.05），但CBP组生存率高于常规治疗组，且ICU住院时间较常规治疗组明显缩短（P<0.05），这可能与CBP治疗后HLA-DR升高有关。单核细胞免疫麻痹是机体免疫功能低下的表现，正确识别脓毒症患者的免疫功能状态并积极的给予免疫调理治疗，观察HLA-DR表达的动态变化，对脓毒症病情逆转、预防MODS的发生以及对预后的判断均具有一定的价值。T淋巴细胞亚群的变化反映了人体细胞免疫机能的改变。CD3+细胞为全血成熟T淋巴细胞，CD4+细胞为辅助/诱导T淋巴细胞，CD8+细胞可对靶细胞产生细胞介导的细胞毒作用，即直接杀伤带有特异性抗原的细胞或相应的靶细胞，对CD4+细胞具有调节性抑制作用，CD4+/CD8+比值可反映机体免疫功能状态，CD4+/CD8+比值降低反映细胞免疫功能抑制[21，22]。本研究结果显示：脓毒症患者CD3+、CD4+下降，CD4+/CD8+也低于正常，80%的患者比值异常[21]，表明脓毒症患者存在免疫功能紊乱[21，23]。CBP治疗后患者APACHEII评分和SOFA评分均下降（P<0.05），CD3+、CD4+、CD4+/CD8+比值均有不同程度的升高（P<0.05），提示CBP能改善脓毒症患者免疫功能，具有双向调节功能。CBP治疗改善能严重脓毒症患者免疫功能的机制尚不清楚，可能有[24]：1)清除炎症介质，阻断TH1向TH2的漂移减轻淋巴细胞异常凋亡；2）清除血中存在的除炎症介质以外的其他毒性物质及某些致病因子；3）改善血管内皮细胞功能，抑制炎症系统