应用噬菌体抗体库技术制备抗体

应用噬菌体抗体库技术制备抗体应用噬菌体抗体库技术制备抗体应用噬菌体抗体库技术制备抗体xxx公司应用噬菌体抗体库技术制备抗体文件编号：文件日期：修订次数：第1.0次更改批准审核制定方案设计，管理制度应用噬菌体抗体库技术制备抗体摘要：噬茵体抗体库技术是利用PCR扩增出抗体的全套可变区基因，将抗体分子DNA片断如Fab或单链抗体(scFv)与噬茼体外壳蛋白基因PⅢ或PVI]I连接，使融合蛋白表达于噬茵体颗粒的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程富集筛选特异性抗体.。这一技术将抗体基因型和表型联系在一起，使识剐抗原的能力和噬茵体的可扩增性统一起来，较好的模拟了体内的抗体产生的过程，成为一种高效的筛选体系。噬菌体抗体库是近年发展起来的一项分子生物学新技术。构建容量大、特异性高和敏感性强的人源性抗体是此项技术的核心，也是其远大前景的基础.本文就噬茵体抗体库技术的原理、构建、筛选做一综述。关键词：噬茵体抗体库技术；抗体库；噬茵体噬菌体抗体库技术(phagedisplayantibodyli—brarytechniques)是指用聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把Fab段或单链抗体(ScFv)表达在噬菌体的表面，经过“吸附一洗脱一扩增”过程筛选并富集特异性抗体。20世纪80年代中期，Smith在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术。由于该技术具有生产人抗体的潜力，因此，吸引了许多学者投入这一研究中，使得噬菌体抗体库技术得以迅速发展，并由此开创了一条简便、快速的基因工程抗体生产路线.1噬菌体抗体库技术的基本原理噬菌体抗体库技术的原理是将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因与噬菌体的外壳蛋白Ill(PIl1)或外壳蛋白Ⅷ(PⅧ)基因随机重组，继而感染大肠杆菌，经增殖并在噬菌体表面以抗体片段Fab或ScFv一外壳蛋白融合蛋白的形式表达。这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程就能筛选并富集特异性抗体。所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。它的最大特点是实现了直接将基因型和表型联系在一起，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性抗体。2噬菌体抗体库的构建噬菌体抗体库按抗体基因的性质分为DNA文库和cDNA文库，按抗体基因的来源分天然抗体库、免疫抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库等。免疫球蛋白基因可来源于杂交瘤细胞、体外免疫的细胞、致敏及非致敏的B淋巴细胞(骨髓、外周血、病灶局部引流淋巴结、扁桃体或经过免疫的小鼠脾脏等)，其中以淋巴结的B淋巴细胞较好。建库的大致过程是：首先提取细胞的总RNA，经过RT—PCR扩增可变区基因，运用两种不同的限制性内切酶分别对纯化的轻链PCR产物和表达载体进行酶切，再对切割产物进行分离纯化，按一定比例将载体和轻链连接，转化感受态细胞并扩大培养，提取质粒即为轻链库。再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切，纯化后按一定比例连接、转化感受态细胞并扩大培养，提取质粒既为轻链库。再对重链PCR产物和轻链库进行双酶切，纯化后按一定比例连接、转化感受态细胞，加入辅助噬菌体培养，离心取上清，加入聚乙二醇(PEG)沉淀并收集噬菌体颗粒，这样就得到噬菌体总抗体库。3噬菌体抗体库的表达载体和筛选噬菌体抗体库的表达载体可分为入噬菌体(phage入)、单链丝状噬菌体(filamentousphage)及噬菌粒(phagemid)三种系统，这三种系统各有其利弊。入噬菌体表达系统可通过菌斑印迹(plaquelift)筛选克隆，但外源性片段不能太大，其库容量较小(106)。丝状噬菌体主要为Winter实验室所采用，目前已构建了fdCAT1及fdD()Gl，并已制备ScFv；在此载体中又包括单价及多价两个子系统，可筛选出高亲和力抗体。噬菌粒是应用最多的表达载体，也是简便高效模拟B细胞产生抗体的原核表达系统。建抗体库的目的是筛选出各种特异性的抗体分子，噬菌体抗体库在这方面有无可比拟的优势。经典的筛选方法有两种：一是将纯抗体包被在固相介质上，如酶标板、免疫试管或亲和层析柱，然后加入待筛选的噬菌体，洗去非亲和性的噬菌体，回收高亲和性的噬菌体；二是将抗体与生物素基团相连，再将其固定在包被有链霉蛋白抗生素的顺磁珠上对噬菌体进行筛选。在筛选过程中，噬菌体种类、固相介质表面的抗原密度或溶液中抗原的浓度和清洗时间三种因素对筛选的效率影响较大。同时，每一轮筛选都需要进行检测，以证实筛选的有效性。4噬菌体抗体库技术的优点①方法简单易行，节省时间，可通过发酵生产来大量制备；②筛选容量增大，可在数周内筛选100万～1亿个克隆，可获得高亲和力的人源化抗体；③直接从未经免疫的人或小鼠的淋巴细胞中得到抗体基因，因此可以获得完全人源化的抗体，克服了杂交瘤细胞不稳定的缺点，避开了人工免疫和杂交瘤技术；④模拟体内免疫过程和天然全套抗体库，随意“制造”和克隆针对任何抗原的抗体。5结语不可否认，噬菌体抗体库技术已显示强劲的发展势头，它的价值不仅仅在于抗体的制备，其强大的筛选能力已广泛地应用到免疫学、细胞生物学、药理学、蛋白质工程等诸多领域。后基因组时代的到来，就是研究