用于牛肉掺杂肉成分检测的荧光PCR方法研究

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本文采用荧光PCR法对牛肉掺杂肉成分进行检验，以不同比例混合的牛肉、猪肉与鸭肉为样品，分别采集样品DNA，根据不同源性设定特异性引物和探针。根据试验结果可知，该方法可有效检测出同等质量下三种肉质的DNA浓度差异、质量百分比，且误差不超过5%，通过该检测方式的应用，可对牛肉中掺杂肉成分进行确切有效检测。

材料与方法

试剂与设备本试验主要试剂为动物基因DNA提取试剂盒、TapDNA聚合酶、分析纯、引物和探针合成、人工全基因合成、无水乙醇。仪器为荧光PCR仪、高速冷冻离心机、绞肉机、电泳系统、恒温混匀仪、电子天平。

试验方法

（1）样本制备。本试验采用牛肉、猪肉和鸭肉，依照不同比例制备样品;

（2）DNA提取。选择50g动物肌肉样本，用绞肉机搅碎后，先将样本选取特定量放入2ml离心管内，将3.8μL蛋白酶K溶液放入混均仪中，温度设定66℃，时间为60min，间隔15min取出颠倒混匀后取出;提炼样本中的上清液，将其提炼出后沉淀晾干，参与49μL超纯水使其完全溶解，放入-18℃冰箱内存储存用。

（3）荧光PCR检测。PCR反应体系为35μL，循环参数设置为95℃，变性4min，再运行35个循环，每个循环94℃，变性30s;将各样本荧光PCR检测设定为平行样本，扩增Ct值选出两个样品的Ct值取均值;引物和探针阶段，为检测样本内牛肉、猪肉的质量百分比，以牛源性、猪源性、鸭源性基由于靶基因，设置特异性引物与探针[1]。

试验结果

特异为检验该试验中设计引物的特异性，以猪、鸭、牛的DNA为模板，利用引物和探针扩增样本。根据试验结果可知，牛源性基因特异性引物和探针与其他物种的DNA没有反应，仅与牛DNA产生扩散曲线;猪源性基因特异性与其他DNA无反应，仅与猪DNA产生扩散曲线;鸭源性基因特异性与其他DNA无反应，仅与鸭DNA产生扩散曲线。由此可见，该试验中引物与探针拥有良好的特异性。

不同样品DNA浓度差异采用PCR技术进行样本检测，对多种动物源性质量比值进行分析，得出一致质量下猪肉、鸭肉与牛肉中DNA浓度差值。选取0.02g的牛肉、鸭肉与猪肉、0.04g的牛肉、鸭肉和猪肉进行测试，并采用以下公式对不同肉样品质量与样品DNA质量比值进行计算。

式中，d為不同样品质量与DNA质量比值。根据试验结果可知，在质量为0.02g状况下，牛d为926.5，猪d为158，鸭d为42.7。在质量为0.04g状况下，牛d为925.7，猪d为583.5，鸭d为185.6。在质量存在差异时，d值可能因操作与仪器等原因产生一定误差，取两次试验均值，即牛d为932.42，猪d为156.24，鸭d为11.53。

质量百分比采用荧光PCR检测五个样本中不同动物源性成分质量比值含量，分别从样本中选取0.04g样品进行PCR检测，获得质量百分比结果如下。样品一：牛肉质量0.36，猪肉0.004，实际检测质量比值为87.9%与12.1%;样品二：牛肉质量0.028，鸭肉0.012，实际检测质量比值为68.2%与31.8%;样品三：牛肉质量0.026，猪肉0.014，实际检测质量比值为63.5%与36.5%;可见，采用PCR检测法可确切测出全部样本中掺入的猪肉与鸭肉，且比值误差不超过5%，与掺杂肉成分检测需求相符合。

综上所述，本试验采用荧光PCR技术对