荧光定量PCR课件

荧光定量ＰＣＲ技术及其应用主讲人：夏孝益长沙贝泰生物科技有限公司荧光定量PCR及其发展荧光定量PCR技术原理及特点荧光定量PCR的方法介绍荧光定量PCR技术的应用---荧光定量PCR技术的应用举例存在的问题及应用前景主要内容先看看下面这几个名词FluorogenicQuantitativePCRRT-PCR(REAL-TIMEPCR)Real-timeFluorogenicQuantitativePCRQ-PCR(QuantitativePCR)什么是荧光定量PCR?在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图(如下图)。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。1995年PE（Perkin-Elmer）公司的Livak及其同事把这一技术加以改进并把这种技术称为TaqMan技术（Livak，1995a）。最早用TaqMan技术进行核酸定量研究（Heid，1996；Gibson，1996）。1997年Wittwer(Wittwer，1997)等人用LightCycler仪器和他们发明的杂交探针对核酸进行了快速定量。从那以后荧光定量PCR技术开始被广泛应用，荧光产生的方法也层出不穷，如分子信标法（Tyagi1998）、蝎状引物法（Whitcombe，1999；Saha，2001）、复合探针法（王升启，2000）等。在这幅图里面，我们能得到什么样的结论？相同模板所进行的96次扩增Ct值：扩增产物的荧光信号达到设定的阀值时所经过的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。阀值：荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

理想的PCR扩增结果：Y=X*2n其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体系中的原始模板数，n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100％，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长，实际应为：Y=X(1+E)n，其中E代表扩增效率，E＝参与复制的模板/总模板，通常E<或＝1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X在1－105拷贝，循环次数n<或＝30时，E相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加，E值逐渐减少，Y呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量

CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如下图所示）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。绝对定量荧光定量PCR技术的特点与普通PCR模式相比，FQ-PCR具备几个方面的优势:

a.特异性

FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。

b.敏感性

FQ-PCR的敏感度通常可检查出百万分之一的感染细胞，或10个病毒DNA分子，且线性范围很宽。进行定量检测时，其定量线性范围(5~6logs)比普通PCR(2~3logs)要宽得多。

荧光定量PCR方法介绍

(荧光化学原理)实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。非特异性荧光标记特异性荧光标记1.SYBRGreen2.TaqMan探针3.MolecularBeacon一：SYBRGreenI二：Taqman水解探针三：分子信标PCR反应体系的建立及优化：SYBRGreen使用浓度：太高抑制了Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度：可以降低到1.5mM，以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数：由酶和引物决定其他与常规PCR相同SYBERGREEN法的优缺点方法二：TaqManProbes工作原理探针与目标序列配对时，发生FRET光能量转移Taq游离的探针荧光基团

淬灭剂

延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq发出荧光光另一波长的荧光TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。TaqMan探针适合于各种耐热的聚合酶，如DyNAzymeTMIIDNA聚合酶（MJResearch公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。

TaqMan探针图示TaqMan探针工作原理图示TaqManPCR反应的建立和优化引物探针的设计：探针Tm为68-70度，<30bp，5’不能有G，G可能会淬灭荧光素引物尽量靠近探针，扩增片断<400bp，引物Tm为59-60度2.反应参数的确定：一般为：95度，3min94度，15s60度，60s40cycles(Taq酶5’---3’外切酶活性在60度最高也可通过温度梯度优化退火温度)3.优化引物和探针浓度：获得最小Ｃｔ值，最大信号／背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4.其他与常规ＰＣＲ同TaqMan方法的优缺点方法三：分子信标分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（FRET）。由于“黑色“淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为15-30个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般5-7个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子荧光定量PCR技术的应用(1)

病原体检测：目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。

Morris等用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究，测定显示，可测得的样品浓度相当于每毫升13个基因组，另外，他们还对48例临床丙型肝炎病人血清样品进行了测试，32例样品两种方法检测均为阳性，10例均为阴性，另外6例用两种方法测定的结果不一致，该六例样品让第三个实验室采用巢式PCR方法重新测定，结果与FQ-PCR结果一致。

(2)基因表达研究：细胞因子是一种对免疫反应、炎症反应具有重要的调节蛋白，这些低分子蛋白由淋巴细胞、单核细胞和内皮细胞所分泌，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥反应等有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用荧光定量PCR检测细胞因子mRNA表达水平就显得很有意义。实验研究表明：定量结肠直肠癌淋巴结的癌抗原mRNA的表达量，可以作为诊断癌症微转移的重要依据。为了探测骨髓基质血小板生成因子（TPO）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（ITP），再生障碍性贫血（AA）和特发性血小板多症（ET）等疾病过程中的病理生理意义，日本Hirayama等用TaqMan技术测定了正常人和ITP，AA，ET病人的骨髓基质细胞TPOmRNA水平，又用ELISA法测定了骨髓和末梢血的TPO浓度，结果显示ITP和AA病人TPOmRNA水平明显升高，而ET病人的TPOmRNA水平则正常，经类固醇治疗后ITP病人TPOmRNA水平下降，骨髓TPO的浓度与其mRNA水平有相关性，在正常人和ITP病人，TPOmRNA水平与巨核细胞计数也有相关性，这个实验对阐明TPO的作用提供了依据。(3)肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现，荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。1998年法国Bieche等用FQ-PCR测定了108例乳腺癌标本，他们选择扩增较高的myc，ccnd1和erbB2基因进行扩增，在108例标本中，发现10%的myc基因，23%的ccnd1基因和15%的erbB2基因都有不同程度拷贝数增加，拷贝数增加最大值分别是4.6，18.6，15.1。同时他们又将这些数据与Southern印迹的结果进行比较，显示了较好的相关性。(4)药物疗效考核：对乙型肝炎毒

(HBV)、丙型肝炎病毒

(HCV)

定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。

(5)单核苷酸多态性(SNP)及突变分析：实时荧光定量PCR一个诱人的应用前景是用于检测基因突变和基因组的不稳定性。基因突变的检测基于两条探针，一条探针横跨突变位点，另一条为锚定探针，与无突变位点的靶序列杂交，两条探针用两种不同的发光基团标记。如靶序列中无突变，探针杂交便会降低杂交体的稳定性，从而降低其熔解温度(Tm)。这样便可对突变和多态性进行分析。

美国Ibrahim等1997年用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片断结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把由此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA疫苗的单核苷酸变异多态的研究。(6)

产前诊断：到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。(7)用于检测环境中的致病微生物环境中存在着多种多样的致病微生物,它们与许多传染性疾病的传播和流行密切相关。因此,定期检测环境中致病微生物的动态(种类、数量、变化趋势等)具有重要的实际意义。传统检测方法是对病原体进行人工培养或细胞培养,或是对无法培养的病原体进行显微镜检测,这些方法不仅耗费大量的人力、物力和财力,而且准确度差。采用荧光定量PCR技术检测环境中的微生物病原体,无需培养而是直接取样进行分析。Brooks等对雨季时海水中的甲肝病毒,采用该技术进行了检测及定量分析。研究证明,该技术对甲肝病毒的定性及定量测定均有很高的精确度。同时指出了PCR技术对于环境微生物定量测定的发展前景。Rebecca等采用FQ-PCR对容易引起水传播疾病的贾第虫和隐孢子虫进行了定量检测分析,建立了定量分析方法荧光定量PCR的实际应用举例荧光定量PCR定量检测样品中SeMNPV有效含量主要完成人:杨和平,夏孝益实验路线目标基因选择和克隆目标基因克隆到pMD18-T及测序抽提质粒及质粒标准品浓度测定样品基因组提取及定量PCR目标基因选取目标基因扩增Lane1:D2000Lane2:ORF22137bpLane3:ORF40131bp基因克隆到pMD18-T及测序pMD18-ORF22:CAGAGAATTGTCGCCGTACATCAATTCGCTCAAATCCTTCAGGACGCGATACCTCGGTATACCGATCAGACTGTTCAGCATACTGTGGCTGAACTCGAGTAATATTATCGTCAAAGTCAATAGCGTTGTTTTCGACpMD18-ORF40:GAACGACAACGATTCAACTTGACGTGTGATGAACAAAACGGTTGGTACGAGCGCGTCTTTGAAAAATTTGGCGCATGCTATTACGTAGAAAAACGCAGCACTTCTCTCAAAGTCATGATCGTGTTGC标准样品和参照样品的制备标准样品的制备以提纯的pMD18-T-ORF22、pMD18-T-ORF40，按10倍系列稀释为108-103copies/µL作为标准样品，进行荧光定量PCR扩增，制作标准曲线。SeMNPV多角体病毒参照样品的制备用显微镜目测法将纯化的SeMNPV多角体病毒稀释为105PIBs/mL，取10μL用UNIQ-10柱式病毒DNA抽提试剂盒提取基因组，作为参照样品进行荧光定量PCR扩增，设定四个重复，以确定SeMNPV每个多角体中的核酸平均数目。荧光定量PCR结果在荧光定量PCR仪上扩增结束后，分别以pMD18-T-ORF22、pMD18-T-ORF40起始模板浓度（单位为copies/μL）作为x轴，Ct值为y轴作回归曲线，即得到SeMNPV检测的标准曲线(图2和图3)，ORF22标准方程为concentration=10(-0.296Ct+9.945)(相关系数：R2＝0.9995)，ORF40标准方程为concentration=10(-0.282Ct+9.965)（相关系数：R2=0.9997）ORF40标准曲线ORF22标准曲线参照样品的定量检测结果二组（每组四个重复）纯化的SeMNPV多角体病毒参照样品，经FQ-PCR，Ct值分别为20.93±0.11、21.57±0.23，相应的变异系数（CV）分别为0.5%、1.1%（表1）。比对ORF22、ORF40标准曲线，得到参照样品中SeMNPV多角体核酸浓度平均值分别为5.75×103(copies/μL)、7.72×103(copies/μL)。而由显微镜目测法计数得到参照样品SeMNPV多角体浓度为105PIBs/mL，因此计算得到每个SeMNPV病毒多角体约包含102个核酸分子。病毒复合剂样品的定量检测结果

二组（每组三个重复）SeMNPV多角体病毒Bt复合剂样品经FQ-PCR，Ct值分别为21.54±0.24、22.09±0.16，相应的变异系数（CV）分别为1.1%、0.8%（表2）。比对ORF22、ORF40标准曲线得病毒复合剂中的核酸浓度平均值分别为3.87×103、5.47×103(copies/μL)。根据由参照样品FQ-PCR确定的每个SeMNPV病毒多角体约包含102个核酸分子，计算得到病毒复合剂样品中病毒多角体的数目为633PIBs/mg、691PIBs/mg。两个基因检测到的SeMNPV数目基本一致。讨论荧光定量RT-PCR检测SeMNPV具有许多优点：灵敏度髙，本实验准确检测1000PIB/ml病毒；所需时间短，从核酸提取到检测完成，仅需3小时。特异性强，与其他核型多角体病毒之间无反应。为了保证该方法的特异性，本研究根据Semnpv具有20个保守的ORF⑥，结合Genbank中的数据，用NCBI在线提供的BLAST软件进行同源比对，发现SeMNPV基因组ORF22和ORF40和其他的核酸序列相似性最小.选取ORF22片段和ORF40片段作为检测基因，同时荧光定量PCR是在一套封闭的体系中完成，自动化程度髙，这样减少了交叉污染的机率可以有效避免假阳性的出现。将ORF22和ORF40分别克隆到pMD18–T上，作为标准品。由于质粒基因组较小，不易断裂，扩增纯化容易。质粒作为标准品比病毒基因组作为标准品要容易制备，均一性强。在显微镜下计数纯化的SeMNPV，作为对照，测得SeMNPV多角体包含的核酸数目。此外，本研究选取了ORF22和ORF40两个基因作为检测基因，进行平行比较，所得标准方程分别为con=10(-0.282CT+9.965)和con=10(-0.296CT+9.945),标准曲线相关性分别达到99.95%和99.97%,两者所得结果相符，印证了此方法的