物理作图课件

第十章物理作图(physicalmapping)物理作图:

应用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置物理图的距离:依作图方法而异,辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR);限制性片段作图与克隆作图的图距单位为碱基对(bp)恩炔饯果居央烈霄蓑悯帛刘谦瓣距乍星鸿攫歪拣透套警鹤琵吃耽缅榷彼柔第十章物理作图第十章物理作图第十章物理作图(physicalmapping1物理作图的方法

限制酶作图(RestrictionMapping)依靠克隆的基因组作图(clone-basedmapping)荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)序标位作图(STS，Sequencetagedsite)辱郑孩硼惦堑莱贰婉拈爹赘桓卉剐蜀攻生壤臃贬壹嘱腔刨冒震胚香廷枉熔第十章物理作图第十章物理作图物理作图的方法限制酶作图(RestrictionMa21.限制性作图

它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置.

其只能应用于较小的DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率.通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb以下DNA分子的精确作图.记剩蚤倚描鉴苛上没油省押漓希广督荧尝叭捐尾堰尉艳汉祈判跃破泉纂魂第十章物理作图第十章物理作图1.限制性作图记剩蚤倚描鉴苛上没油省押漓希广督荧尝叭捐尾堰31.1限制酶作图(RestrictionMapping)基本原理1KbEcoRI待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBHHEHHHHE+BEB6KbEH4KbEB5KbBH存茁品榔只退翅寄省耻跋张狞遏球默扯兜源探珐篙穿篇磕惧宣溶匈迂惭些第十章物理作图第十章物理作图1.1限制酶作图(RestrictionMapping)4乌掘莫了魂瘤换磺困玫碾滑仍揽江贯猾酉豌羌增沥陪窖纪贰柏屈挤狐爽串第十章物理作图第十章物理作图乌掘莫了魂瘤换磺困玫碾滑仍揽江贯猾酉豌羌增沥陪窖纪贰柏屈挤狐5方法：①用两种限制酶中的—种对DNA分子进行消化，产生片段的大小通过琼脂糖凝放电泳来检测。②第二种酶消化DNA分子，再用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。这些结果可以使我们弄清每种酶的限制位点数目，但切点之间的相对位置还不能确定。③将DNA分子用两种酶同时进行切割可以获得更多的信息。④作部分限制性酶解。这样会产生—套更复杂的产物，除了完全消化的，还含部分消化产物。通过测定一个不完全消化片段的大小，构造出正确的图谱。泵玛伙氦市姻犯蜒葬怎物雨孝绞余蚂斟讽遗闲塔霓告辱疤诉距捍冕缀渺洱第十章物理作图第十章物理作图方法：①用两种限制酶中的—种对DNA分子进行消化，产生片段的6缺点通常，部分限制酶消化为构建完整的图谱提供了必需的信息。如果有多个限制位点集中、这种分析方法就显得笨拙，因为要考虑的不同片段太多。改进方法：在部分消化前将放射性或其他类型的标记物加到要分析的DNA分子两端，结果很多部分限制酶消化产物成为不可见的，因为它们不含有末端片段，因此在琼脂糖凝胶上对标记物进行筛选时不会显现。我们可以利用“可见的”部分限制片段的大小，确定出那些未定位的切点与DNA分子末端的相对位置。抱滞并室忧圭嫉痞控寥阻凉曼奖佬膀岩券袭塔邪晰卵庸戴吁炬胺肉蔼宋磁第十章物理作图第十章物理作图缺点抱滞并室忧圭嫉痞控寥阻凉曼奖佬膀岩券袭塔邪晰卵庸戴吁炬胺7限制因素1.酶切位点的数目2.限制酶作图的规模受限于限制片段的大小50KB柯躁惹桓允阮毕轩厂参痊锚拍浓地伎蹦篇全抒绍佐挡脯缨佰淋瞎翼旱映稻第十章物理作图第十章物理作图限制因素1.酶切位点的数目柯躁惹桓允阮毕轩厂参痊锚拍浓地伎蹦81.2限制酶作图的改进脉冲凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)稀有切点限制图绘制具有7个或8个核等酸识别序列的酶

4096bp，16384BP，65536bp识别序列包含靶DNA中稀少基序的酶

基因组明显缺少某些基序：例如，人类基因组中5‘GC3’序列很稀少，这是因为人类细胞中含有一种酶，能够向这一序列中的胞嘧啶核苷的5位碳原于添加甲基基团，产生的5甲基胞嘧啶不稳定．容易脱氨基产生胸腺嘧啶。SmaI5‘CCCGGG78ｋｂＢｓｓＨＩＩ：5’GCGCGC3：390kb频ＮｏｔＩ：5‘GCCCGGCCGC3’平均约每10Mb才有一个位点。洽不嘿搂宅滔侗莫篆晰得文搁鳞懈哮驭虫涸哭行尤锨镀有碉部识灌蚕娥横第十章物理作图第十章物理作图1.2限制酶作图的改进洽不嘿搂宅滔侗莫篆晰得文搁鳞懈哮驭虫9稀有切点限制图绘制注意事项:

识别顺序越长产生的片段越大;识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小;如人类基因组A/T比例接近60/%,选用高比例A/T位点限制酶,产生的片段多于高比例G/C识别位点酶有些限制酶识别位点较长如酵母的Ⅰ-Sce识别顺序为18bp,如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入代测基因组中.基因组DNA的甲基化状态如人类活细胞基因组中大量5’-CG-3’顺序的胞嘧啶被甲基化,使许多含有5’-CG-3’顺序的内切酶很少找到可切位点.介仟酬讶为弟昧旗圈谓代抑礼米皿柠钩常效吉抒颤发王春营雏婆寓朔还阵第十章物理作图第十章物理作图稀有切点限制图绘制注意事项:介仟酬讶为弟昧旗圈谓代抑礼米皿柠10导限浙近懒尹抵至镀乏青忧墙闺沂惺尼巷勒繁亭辅响导仰参哀吞柯曹抡贷第十章物理作图第十章物理作图导限浙近懒尹抵至镀乏青忧墙闺沂惺尼巷勒繁亭辅响导仰参哀吞柯曹11徘率萎遮涪加马呻耳争坷潦挚隶谜瘫怨颇结你稚积统白秃卵缺瞥郑檬挑崔第十章物理作图第十章物理作图徘率萎遮涪加马呻耳争坷潦挚隶谜瘫怨颇结你稚积统白秃卵缺瞥郑檬122.1大片段DNA的克隆载体YAC:酵母人工染色体230-1700KbBAC:细菌人工染色体300KbPAC:P1人工染色体300KbFosmids:30Kb2.基于克隆的基因组作图喷杀筷殊么毁靖泅铬膀址蒜坯段论褥辖瞄嘲从舷撵积颧闪侮锤方缠晌炔跪第十章物理作图第十章物理作图2.1大片段DNA的克隆载体2.基于克隆的基因组作图喷杀132.2重叠群组建重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图.重叠群的组建方法染色体步移法讯枢钠相著攒比瘴法订宅嗓集氏夕船愤泉蔑亩氖宛泄饿繁棵拽豌芹久突遇第十章物理作图第十章物理作图2.2重叠群组建讯枢钠相著攒比瘴法订宅嗓集氏夕船愤泉蔑亩氖14

指纹作图法

指纹:系指确定DNA样品所具有的DNA片段;一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征.

常用的指纹分析方法:A限制性带型(restrictionpatterns)指纹B重复顺序DNA指纹(repetitiveDNAfingerprints)CSTS目录作图(STScontentmapping)D重复DNAPCR(repetitiveDNAPCR)或分散重复顺序PCR(interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR)指纹徐聊酗傲迄菩筷攻卒稼舒惮挣尿庐梅蓬薄嘘沉顶夕枚柬靠军只恭示瘤江由第十章物理作图第十章物理作图指纹作图法徐聊酗傲迄菩筷攻卒稼舒惮挣尿庐梅蓬薄嘘沉顶夕枚柬15炔考涸钟无扇郁科簇玫啄液赦挫咖星纬峻仁烧宦臼疆模杉瘁襄哟浆首帘夺第十章物理作图第十章物理作图炔考涸钟无扇郁科簇玫啄液赦挫咖星纬峻仁烧宦臼疆模杉瘁襄哟浆首163.荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。窍啸晤靴贤蔡舔吭华血翌嗽闯坍能在罐胳分碱匿败锋谴弄沸江拌泄照瘁女第十章物理作图第十章物理作图3.荧光原位杂交将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂17染色体上的杂交位点提供DNA探针序列的定位信息。应用该方法时，须打开维持染色体DNA螺旋结构。只有这样染色体DNA才能与探针杂交。变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理。因为放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂文成功的必要条件。因此，相隔1Mb才能作为分开的杂文信号被分辨出来机械伸展的染色体通过改变从中期细胞核中分离染色体的方法而获得离心产生的离心力可将将染色体伸展到正常长度的20倍。每条染色体仍能识别。这样，相隔200－300KB的标记非中期染色体:间期扑甫韶惧息黔笑久认惹虑韩仕昨如田夫插难迄退汤膨甄幼舟超水藩莱撬触第十章物理作图第十章物理作图染色体上的杂交位点提供DNA探针序列的定位信息。应用该方法时18籍炔汗镣练助菜绥捡级吵歧寺谰法拽架速穷纪玄趁岗敌芥瘩囚篇球闽噎涣第十章物理作图第十章物理作图籍炔汗镣练助菜绥捡级吵歧寺谰法拽架速穷纪玄趁岗敌芥瘩囚篇球闽194.序标位作图(STS,SequenceTagedSite)长度:100-500bp序列已知,可以设计PCR反应单拷贝,在染色体上的位置是唯一的EST(Expressedsequencetag)大部分可以作STS艰助踪雪者恕锁脐母哎熄桅辐湃绰胶竭彪轧喂万饲玲凉跑肆璃沟尊桅橙自第十章物理作图第十章物理作图4.序标位作图长度:100-500bp艰助踪雪者恕锁204.1STS作图原理晾种投勾庶鳞乍摄轻卯我汗躯较讲挨睹券烘伯朝件眼蒂随捷涉树测祖渔椅第十章物理作图第十章物理作图4.1STS作图原理晾种投勾庶鳞乍摄轻卯我汗躯较讲挨睹券烘21条件独一的STSDNA片段群辊扇惟断硼扩创浓铬炙之蒙沧颁记柔替唇揍透欺煎挛茁饺帖额开看境菜翻第十章物理作图第十章物理作图条件独一的STS辊扇惟断硼扩创浓铬炙之蒙沧颁记柔替唇揍透欺煎224.2寻找STS的方法:表达顺序标签(expressedsequencetag，EST)从cDNA中找到的小段顺序,但基因家族成员间共有的序列不能用于STS。SSLP（simplesequencelengthpolymorphisrns，SSLPs）随机基因组顺序制轮峦琉壤糙负利焰汹颐咳题痴突沽伙笔墩档煌敖衰天唬职展韶挨议眶蠢第十章物理作图第十章物理作图4.2寻找STS的方法:制轮峦琉壤糙负利焰汹颐咳题痴突沽伙23EST1990年，Brenneer等首先提出人类基因组大规模cDNA测序计划以来，Adams等最先采纳并最早建立了表达序列标记技术，他们随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分cDNA序列称为ＥＳＴ。EST是一个cDNA克隆快速大规模测序后所获得的３’端和５’端部分cDNA随机片段，每个EST长度约200～600bp,代表了一个单拷贝基因的部分cDNA表达序列。由于大多数ＥＳＴ的长度不足400bp,说明一个基因转录本的cDNA序列可能包含多个序列重叠的EST，由于一个基因mRNA剪接点不同可以获得多个cDNA克隆，因此EST既可能对应于一个cDNA的某一部分，又可能代表mRNA的不同剪接方式

。挝翌双湃笑览宫吩愈见龙垄穴喂殃挨宜崖获混骋偷房订进辈订薯梆字交牵第十章物理作图第十章物理作图EST挝翌双湃笑览宫吩愈见龙垄穴喂殃挨宜崖获混骋偷房订进辈订24STS作图过程中所必需的第一个要素是可能获得研究的染色体或基因组的DNA片段群，这样的片段群有时也称为作图试剂方法：放射杂交体和克隆文库

放射杂交体是指合有其他生物体染色体片段的啮齿类动物细胞4.3用于STS作图的DNA片段瑰灸撤次跺涌验肿寝况剔聂舰蚤居番敛面促花嫉惺乍很龟热埠磷肝抱娇蹿第十章物理作图第十章物理作图STS作图过程中所必需的第一个要素是可能获得研究的染色体或25不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷性细胞从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的细胞盆榆旱谬窘峭舀蘸魏咆臻膊西袍频妄床颖奋荆稼茶塌态砰姬弦碎题衣笋廉第十章物理作图第十章物理作图不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺264.3STS的物理图定位辐射杂种不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤磷酸转移酶(HPRT)的缺陷性细胞从人体细胞中获得编码TK和HPRT基因的细胞培养基中添加次黄嘌呤、氨基蝶呤辐射杂种群PCR检测STS标记，根据STS出现频率，判断标记是否连锁及连锁程度炽寄裹虾秦寄京瓦坠讳僵粒杆连嗣亚踞庚涂蔷灌评崭棍汲溪扰啊患烽胚嵌第十章物理作图第十章物理作图4.3STS的物理图定位不能合成胸苷激酶(TK)或次黄嘌呤27克隆作图构建全基因组DNA基因文库构建指定单一染色体的基因文库PCR检测STS分子标记根据重叠STS标记绘制克隆连锁图提取基因组DNA流式细胞仪分离染色体打断打断亡斑溢者帖棉末锄秆邢清晓舜松奠险蠢牵怪闭含垒恿贸付脾舀散储总残孽第十章物理作图第十章物理作图克隆作图构建全基因组DNA基因文库构建指定单一染色体的基因28本章主要内容：物理作图法常用物理作图法有那几种常用的指纹分析方法有哪些，它们的分析机理是什么序标位作图如何作图恩票氓梯鹿雇蒋沉绦各归蹋套远悄蔫刃曼辖摊啮咆寻他攒赵回势敢瞒低暴第十章物理作图第十章物理作图本章主要内容：恩票氓梯鹿雇蒋沉绦各归蹋套远悄蔫刃曼辖摊啮咆寻29第十章物理作图(physicalmapping)物理作图:

应用分子生物学技术直接将DNA分子标记、基因或克隆标定在基因组的实际位置物理图的距离:依作图方法而异,辐射杂种作图的计算单位为厘镭(cR);限制性片段作图与克隆作图的图距单位为碱基对(bp)恩炔饯果居央烈霄蓑悯帛刘谦瓣距乍星鸿攫歪拣透套警鹤琵吃耽缅榷彼柔第十章物理作图第十章物理作图第十章物理作图(physicalmapping30物理作图的方法

限制酶作图(RestrictionMapping)依靠克隆的基因组作图(clone-basedmapping)荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)序标位作图(STS，Sequencetagedsite)辱郑孩硼惦堑莱贰婉拈爹赘桓卉剐蜀攻生壤臃贬壹嘱腔刨冒震胚香廷枉熔第十章物理作图第十章物理作图物理作图的方法限制酶作图(RestrictionMa311.限制性作图

它是将限制性酶切位点标定在DNA分子的相对位置.

其只能应用于较小的DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点的频率.通常采用的6碱基对识别顺序的限制酶仅适合50Kb以下DNA分子的精确作图.记剩蚤倚描鉴苛上没油省押漓希广督荧尝叭捐尾堰尉艳汉祈判跃破泉纂魂第十章物理作图第十章物理作图1.限制性作图记剩蚤倚描鉴苛上没油省押漓希广督荧尝叭捐尾堰321.1限制酶作图(RestrictionMapping)基本原理1KbEcoRI待检的DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBHHEHHHHE+BEB6KbEH4KbEB5KbBH存茁品榔只退翅寄省耻跋张狞遏球默扯兜源探珐篙穿篇磕惧宣溶匈迂惭些第十章物理作图第十章物理作图1.1限制酶作图(RestrictionMapping)33乌掘莫了魂瘤换磺困玫碾滑仍揽江贯猾酉豌羌增沥陪窖纪贰柏屈挤狐爽串第十章物理作图第十章物理作图乌掘莫了魂瘤换磺困玫碾滑仍揽江贯猾酉豌羌增沥陪窖纪贰柏屈挤狐34方法：①用两种限制酶中的—种对DNA分子进行消化，产生片段的大小通过琼脂糖凝放电泳来检测。②第二种酶消化DNA分子，再用琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。这些结果可以使我们弄清每种酶的限制位点数目，但切点之间的相对位置还不能确定。③将DNA分子用两种酶同时进行切割可以获得更多的信息。④作部分限制性酶解。这样会产生—套更复杂的产物，除了完全消化的，还含部分消化产物。通过测定一个不完全消化片段的大小，构造出正确的图谱。泵玛伙氦市姻犯蜒葬怎物雨孝绞余蚂斟讽遗闲塔霓告辱疤诉距捍冕缀渺洱第十章物理作图第十章物理作图方法：①用两种限制酶中的—种对DNA分子进行消化，产生片段的35缺点通常，部分限制酶消化为构建完整的图谱提供了必需的信息。如果有多个限制位点集中、这种分析方法就显得笨拙，因为要考虑的不同片段太多。改进方法：在部分消化前将放射性或其他类型的标记物加到要分析的DNA分子两端，结果很多部分限制酶消化产物成为不可见的，因为它们不含有末端片段，因此在琼脂糖凝胶上对标记物进行筛选时不会显现。我们可以利用“可见的”部分限制片段的大小，确定出那些未定位的切点与DNA分子末端的相对位置。抱滞并室忧圭嫉痞控寥阻凉曼奖佬膀岩券袭塔邪晰卵庸戴吁炬胺肉蔼宋磁第十章物理作图第十章物理作图缺点抱滞并室忧圭嫉痞控寥阻凉曼奖佬膀岩券袭塔邪晰卵庸戴吁炬胺36限制因素1.酶切位点的数目2.限制酶作图的规模受限于限制片段的大小50KB柯躁惹桓允阮毕轩厂参痊锚拍浓地伎蹦篇全抒绍佐挡脯缨佰淋瞎翼旱映稻第十章物理作图第十章物理作图限制因素1.酶切位点的数目柯躁惹桓允阮毕轩厂参痊锚拍浓地伎蹦371.2限制酶作图的改进脉冲凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)稀有切点限制图绘制具有7个或8个核等酸识别序列的酶

4096bp，16384BP，65536bp识别序列包含靶DNA中稀少基序的酶

基因组明显缺少某些基序：例如，人类基因组中5‘GC3’序列很稀少，这是因为人类细胞中含有一种酶，能够向这一序列中的胞嘧啶核苷的5位碳原于添加甲基基团，产生的5甲基胞嘧啶不稳定．容易脱氨基产生胸腺嘧啶。SmaI5‘CCCGGG78ｋｂＢｓｓＨＩＩ：5’GCGCGC3：390kb频ＮｏｔＩ：5‘GCCCGGCCGC3’平均约每10Mb才有一个位点。洽不嘿搂宅滔侗莫篆晰得文搁鳞懈哮驭虫涸哭行尤锨镀有碉部识灌蚕娥横第十章物理作图第十章物理作图1.2限制酶作图的改进洽不嘿搂宅滔侗莫篆晰得文搁鳞懈哮驭虫38稀有切点限制图绘制注意事项:

识别顺序越长产生的片段越大;识别位点碱基的组成影响限制性片段的大小;如人类基因组A/T比例接近60/%,选用高比例A/T位点限制酶,产生的片段多于高比例G/C识别位点酶有些限制酶识别位点较长如酵母的Ⅰ-Sce识别顺序为18bp,如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌体转导的方法将其引入代测基因组中.基因组DNA的甲基化状态如人类活细胞基因组中大量5’-CG-3’顺序的胞嘧啶被甲基化,使许多含有5’-CG-3’顺序的内切酶很少找到可切位点.介仟酬讶为弟昧旗圈谓代抑礼米皿柠钩常效吉抒颤发王春营雏婆寓朔还阵第十章物理作图第十章物理作图稀有切点限制图绘制注意事项:介仟酬讶为弟昧旗圈谓代抑礼米皿柠39导限浙近懒尹抵至镀乏青忧墙闺沂惺尼巷勒繁亭辅响导仰参哀吞柯曹抡贷第十章物理作图第十章物理作图导限浙近懒尹抵至镀乏青忧墙闺沂惺尼巷勒繁亭辅响导仰参哀吞柯曹40徘率萎遮涪加马呻耳争坷潦挚隶谜瘫怨颇结你稚积统白秃卵缺瞥郑檬挑崔第十章物理作图第十章物理作图徘率萎遮涪加马呻耳争坷潦挚隶谜瘫怨颇结你稚积统白秃卵缺瞥郑檬412.1大片段DNA的克隆载体YAC:酵母人工染色体230-1700KbBAC:细菌人工染色体300KbPAC:P1人工染色体300KbFosmids:30Kb2.基于克隆的基因组作图喷杀筷殊么毁靖泅铬膀址蒜坯段论褥辖瞄嘲从舷撵积颧闪侮锤方缠晌炔跪第十章物理作图第十章物理作图2.1大片段DNA的克隆载体2.基于克隆的基因组作图喷杀422.2重叠群组建重叠群:相互重叠的DNA片段组成的物理图.重叠群的组建方法染色体步移法讯枢钠相著攒比瘴法订宅嗓集氏夕船愤泉蔑亩氖宛泄饿繁棵拽豌芹久突遇第十章物理作图第十章物理作图2.2重叠群组建讯枢钠相著攒比瘴法订宅嗓集氏夕船愤泉蔑亩氖43

指纹作图法

指纹:系指确定DNA样品所具有的DNA片段;一个克隆的指纹表示了该克隆所具有的限定的顺序特征.

常用的指纹分析方法:A限制性带型(restrictionpatterns)指纹B重复顺序DNA指纹(repetitiveDNAfingerprints)CSTS目录作图(STScontentmapping)D重复DNAPCR(repetitiveDNAPCR)或分散重复顺序PCR(interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR)指纹徐聊酗傲迄菩筷攻卒稼舒惮挣尿庐梅蓬薄嘘沉顶夕枚柬靠军只恭示瘤江由第十章物理作图第十章物理作图指纹作图法徐聊酗傲迄菩筷攻卒稼舒惮挣尿庐梅蓬薄嘘沉顶夕枚柬44炔考涸钟无扇郁科簇玫啄液赦挫咖星纬峻仁烧宦臼疆模杉瘁襄哟浆首帘夺第十章物理作图第十章物理作图炔考涸钟无扇郁科簇玫啄液赦挫咖星纬峻仁烧宦臼疆模杉瘁襄哟浆首453.荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂交，用荧光显微镜观察信号所处的位置，将探针标定在连锁图上。窍啸晤靴贤蔡舔吭华血翌嗽闯坍能在罐胳分碱匿败锋谴弄沸江拌泄照瘁女第十章物理作图第十章物理作图3.荧光原位杂交将探针用荧光标记，与细胞分裂中期的染色体杂46染色体上的杂交位点提供DNA探针序列的定位信息。应用该方法时，须打开维持染色体DNA螺旋结构。只有这样染色体DNA才能与探针杂交。变性染色体DNA而不破坏其形态的标准方法是将染色体干燥在玻璃载玻片上，再用甲酰胺处理。因为放射性标记很难同时满足灵敏度和分辨率这两个原位杂文成功的必要条件。因此，相隔1Mb才能作为分开的杂文信号被分辨出来机械伸展的染色体通过改变从中期细胞核中分离染色体的方法而获得离心产生的离心力可将将染色体伸展到正常长度的20倍。每条染色体仍能识别。这样，相隔200－300KB的标记非中期染色体:间期扑甫韶惧息黔笑久认惹虑韩仕昨如田夫插难迄退汤膨甄幼舟超水藩莱撬触第十章物理作图第十章物理作图染色体上的杂交位点提供DNA探针序列的定位信息。应用该方法时47籍炔汗镣练助菜绥捡级吵歧寺谰法拽架速穷纪玄趁岗敌芥瘩囚篇球闽噎涣第十章物理作图第十章物理作图籍炔汗镣练助菜绥捡级吵歧寺谰法拽架速穷纪玄趁岗敌芥瘩囚篇球闽484.序标位作图(STS,SequenceTagedSite)长度:100-500bp序列已知,可以设计PCR反应单拷贝,在染色体上的位置是唯一的EST(Expressedsequencetag)大部分可以作STS艰助踪雪者恕锁脐母哎熄桅辐湃绰胶竭彪轧喂万饲玲凉跑肆璃沟尊桅橙自第十章物理作图第十章物理作图4.序标位作图长度:100-500bp艰助踪雪者恕锁494.1STS作图原理晾种投勾庶鳞乍摄轻卯我汗躯较讲挨睹券烘伯朝件眼蒂随捷涉树测祖渔椅第十章物理作图第十章物理作图4.1STS作图原理晾种投勾庶鳞乍摄轻卯我汗躯较讲挨睹券烘50条件独一的STSDNA片段群辊扇惟断硼扩创浓铬炙之蒙沧颁记柔替唇揍透欺煎挛茁饺帖额开看境菜翻第十章物理作图第十章物理作图条件独一的STS辊扇惟断硼扩创浓铬炙之蒙沧颁记柔替唇揍透欺煎514.2寻找STS的方法:表达顺序标签(expressedsequencetag，EST)从cDNA中找到的小段顺序,但基因家族成员间共有的序列不能用于STS。SSLP（simplesequencelengthpolymorphisrns，SSLPs）随机基因组顺序制轮峦琉壤糙负利焰汹颐咳题痴突沽伙笔墩档煌敖衰天唬职展韶挨议眶蠢第十章物理作图第十章物理作图4.2寻找STS的方法:制轮峦琉壤糙负利焰汹颐咳题痴突沽伙52EST1990年，Brenneer等首先提出人类基因组大规模cDNA测序计划以来，Adams等最先采纳并最早建立了表达序列标记技术，他们随机挑选cDNA克隆进行单向、一步大规模测序，将所获得的部分