液相色谱分析法

关于液相色谱分析法第1页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五学习要求掌握液相色谱法的基本原理，了解液相色谱仪的构造，液相色谱法的分类。掌握液相色谱分析方法的选择以及定性定量分析方法；了解HPLC的应用。学习方法建议1.通过文献查阅，理解方法的应用及与理论的结合点。2.采用对比的方式进行GC与HPLC异同点对照，有助于对两种色谱方法的理解。3.从仪器结构上讲搞清楚“高效“的含义。4.对于高效液相色谱的类型，重点在液—固色谱法和化学键合相色谱法的固定相、流动相的特点及其选择。第2页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五第一讲概述一高效液相色谱技术的出现

二、高效HPLC与经典LC方法的比较四、液相色谱分离原理及分类三、HPLC与GC的比较第3页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五

液相色谱是以溶剂液体为流动相的色谱方法。早期，是在直径1～5cm,长50～

500cm的玻璃柱中进行的。即使这样，流速仍然很低(＜1mL/min)，分析时间仍然很长！当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的方法是减小填充物的粒径（3~10m

）！直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。为保证柱流速，固定相颗粒直径多在150～

200m范围内。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。一高效液相色谱技术的出现第4页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；经典方法靠重力加料，速度慢需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV－10-9g,荧光检测器－10-11g。HPLC

具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点,所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。（最高输送压力可达4.9107Pa）(每米塔板数可达几万或几十万)

二、高效HPLC与经典LC方法的比较第5页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五流动相的选择：GC：有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC：采用的流动相为液体或各种液体的混合，除了起运载作用外，可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。分析对象及范围：GC：只限于气体和低沸点的稳定化合物（占有机物总数的20%）HPLC：可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物（占80%）操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。基本理论：LC的塔板理论、速率方程与GC基本一致；基本概念：LC的术语（如保留值等）、定量、定性方法与GC一致。相同点不同点三、HPLC与GC的比较第6页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五根据分离机制不同HPLC分离的实质

根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。样品分子与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。液固吸附色谱化合键合色谱离子交换色谱分子排阻色谱亲和色谱HPLC的分类四、液相色谱分离原理及分类第7页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五第二讲高效液相色谱仪岛津HPLC结构组成一、高压输液系统二、进样系统三、分离系统四、检测器记录系统第8页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五结构示意图高压泵将储液器中的流动相经过进样器输入色谱柱，待分离试样由进样器注入，随流动相一起进入色谱柱分离，被分离组分依次进入检测器，检测信号由记录仪记录或经过数据处理得到色谱图。第9页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五He储液瓶分布器过滤2m高压泵入口检查出口检查脉流消除抽气过滤器反压调节压力计注样阀分离柱检测器储液器HPLC仪器详解第10页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五一、高压输液系统贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2m，可防止颗粒物进行泵内。脱气：超声波脱气或真空加热脱气。高压输液泵：由贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。梯度洗脱装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。

对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。第11页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五低压梯度：如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；高压梯度：如有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。梯度洗脱方式：低压梯度（外梯度）、高压梯度（内梯度）第12页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五二、进样系统

与GC相比，HPLC柱要短得多，因此，由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。对进样器的要求：密封性好、死体积小、重复性好、对系统的压力和流量波动小，便于自动化。（1）隔膜注射进样：微量注射器进样。装置简单、死体积小。进样量小且重现性差。（2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好进样方式第13页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱六通阀进样进色谱柱出口样品量管第14页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五三、分离系统第15页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五三、分离系统内壁光滑的优质不锈钢柱，柱形多为直形，内部充微粒固定相。分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。柱长多为10~30cm，内径为2~5mm色谱柱要求：耐高压、柱接头的死体积尽可能小，

柱温一般为室温或接近室温。常规柱：分析性、制备性快速柱微量柱色谱柱按柱长和内径不同分类第16页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五四、检测器、记录系统两种基本类型的检测器：对HPLC检测器的要求p292溶质型检测器（选择型）仅对被分离组分有响应，如紫外、荧光及电化学检测器等。至今还没有即灵敏、通用又可梯度洗脱的检测器。总体检测器（普通型）对试样和洗脱液总的物理或物理化学性质有响应。如示差折光、介电常数检测器等。第17页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五四、检测器、记录系统（一）紫外吸收检测器（应用广泛）特点：对流量和温度的变化不敏感，适用于梯度洗脱，检出限可达5×10－10g。溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液原理：依据组分对特定紫外光的选择性吸收，其浓度与吸光度的关系符合比尔定律。HPLC分析中，约80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。注意第18页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五（二)光电二极管阵列检测器（DAD：DiodeArrayDetector）可获得吸光度、波长、时间三维彩色图形，得到更多的信息。快速扫描紫外可见分光检测器。快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图波长可的松氟美松皮质酮吸光度第19页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五(三)荧光检测器（FlorescenceDetector，FD）(四)示差折光检测器(DifferdntialRefractometerDetector,)（五)电化学检测器(六)化学发光检测器

许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。灵敏度比UV检测器高1~3个数量级；但线性范围不如UV检测器。灵敏度比UV的低，为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。

其它检测器：MS、IR等第20页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五LC检测器性能一览表了解以上检测器的特点、性能、适用范围、灵敏度等。第21页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五第三讲HPLC方法简介根据固定相和分离机理不同HPLC分为四类：

尺寸排阻（凝胶）色谱离子交换和离子色谱固体吸附剂吸附方法固定相平衡类型不相溶液体间的分配固定液体涂于载体有机基团键合于固体表面液体和键合体表面间的分配离子交换树脂离子交换液体附于多孔聚合物分配／筛析流动相：与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂（又叫淋洗液、洗脱剂），它既有运载作用，又和固定相一样，与组分相互作用。液固吸附色谱分配色谱键合相色谱液液色谱第22页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五（1）对待测物具一定极性和选择性；（2）与检测器相匹配；（3）高纯度：否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；（4）化学稳定性好；（5）适宜的粘度：粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。理想的流动相应有下列特性：第23页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五（一）液固吸附色谱固定相吸附剂：(硅胶吸附剂应用最广。)极性的：无机氧化物、硅胶、氧化铝、分子筛；非极性的：活性碳。选择流动相的基本原则：极性大的试样用极性强的流动相极性小的试样用极性低的流动相分析对象：分离极性不同的试样或异构体。保留机制：组分分子和流动相分子对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附，与吸附剂性质类似的容易被吸附，呈现较高的保留值。基于各组分在吸附剂表面上具有不同的吸附能力而分离。第24页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五（二）液液分配色谱流动相：为防止固定相的流失，流动相与固定液应尽量不互溶，或者说二者的极性相差越大越好。固定相：常用硅胶为载体，在其表面涂渍固定液。常用固定液：按极性由高到低为：,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。正相液相色谱（Normal-phaseChromatography）反相液相色谱（Reversed-phaseChromatography）固定相：极性（如水、甲醇）流动相：非极性（如烷烃）固定相：非极性（如烷烃）流动相：极性（如水、甲醇）主要用于分离极性化合物，按极性小的流出。主要用于分离非极性化合物，极性大的先流出，第25页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五待测物在互不相溶的两相中溶解度不同，故分配系数不同，被测物在两相间反复多次分配，产生差速迁移，实现分离。保留机制根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型。由于固定液与载体松散的结合，固定液易流失，分离稳定性及重现性差，不能采用高流速和梯度洗脱。

机械涂渍型为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。

化学键合型通过共价键将有机固定液结合到在载体（硅胶）而得到各种性能的固定相。键合相色谱第26页，共33页，2022年，5月20日，6点40分，星期五（三）键合相色谱固定相分类：按有机基团的性质分：极性、非极性、离子交换等。特点可用于正相色谱和反相色谱，HPLC约75%使用反相色谱法。固定相（非极性键合相）：如十八烷基键合硅胶Octadecysilance、即C18又称ODS固定相）流动相（极性大）：甲醇－水、乙腈－水、无机盐的缓冲液等多用于多环芳烃等低极性化合物分