萌发进程种子基本生物大分子含量变化及呼吸-光合作用调节

萌发进程种子基本生物大分子含量变化及呼吸-光合作用调节目的要求学习和掌握从植物组织中提取蛋白质、糖及核酸的原理和操作技术；学习和掌握蛋白质、糖及核酸的含量检测原理和基本方法；学习测定生物反应进程中的气体含量变化相关反应的研究、分析和测定方法生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。生物大分子的特点在于其表现出的各种生物活性和在生物新陈代谢中的作用。生物大分子大多数是由简单的组成结构聚合而成的，eg.蛋白质的组成单位是氨基酸，核酸的组成单位是核苷酸。生物大分子都可以在生物体内由简单的结构合成，也都可以在生物体内经过分解作用被分解为简单结构，一般在合成的过程中消耗能量，分解的过程中释放能量。理论基础理论基础

蛋白质、核酸和多糖是3类主要的生物大分子，它们在分子结构和生理功能上差别很大，然而，在以下几个方面又显出共性：在活细胞内，生物大分子和相应的生物小分子之间的互变，通常通过脱水缩合，或加水分解。蛋白质链（或称肽链）、核酸链和糖链都有方向性，尽管方向性的体现各不相同。蛋白质、核酸和多糖分子都有各具特征的高级结构，正确的高级结构是生物大分子执行其生物功能的必要前提。

在活细胞中，三类生物大分子密切配合，共同参与生命过程，甚至很多情况下形成生命活动必不可少的复合大分子，如核蛋白、糖蛋白。核苷酸氨基酸乙酰辅酶A+甘油丙酮酸蛋白质核酸脂类糖类TCA循环理论基础植物的光合作用动植物所需要的能量最终来源于——太阳光能，光能通过光合作用被生物体储存成生物体所需的化学能。光合作用：生物体利用光能把CO2和H2O转化成储存能量的有机物并释放O2的过程。植物、大多数藻类和蓝藻可以进行光合作用，它们被称为光合自养生物。以蓝藻为例不存在叶绿体这一细胞器。光合自养生物提供维持地球生物生存所需的大气中的氧浓度、所有的有机化合物和大部分能量。光合作用的过程：色素分子可见光C52C3ADP+PiATP2H2OO24[H]多种酶酶(CH2O)CO2吸收光解能固定还原酶光反应暗反应植物的呼吸作用呼吸作用：细胞内的营养物质转化为能量的过程。有氧呼吸的三个阶段葡萄糖的初步分解C6H12O6酶2CH3COCOOH+4[H]+2ATP

（丙酮酸）场所：细胞质基质①丙酮酸彻底分解酶6CO2

+20[H]+2ATP场所：线粒体基质②2CH3COCOOH（丙酮酸）[H]的氧化酶12H2O+34ATP场所：线粒体内膜③24[H]+6O2+6H2O有氧呼吸：（1）主要场所——线粒体

（2）总反应式：C6H12O6+6H2O+6O26CO2+12H2O+能量酶38ATP无氧呼吸第一阶段：C6H12O62CH3COCOOH+4[H]+2ATP

（丙酮酸）酶场所：细胞质基质场所：细胞质基质第二阶段：2CH3COCOOH+4[H]

（丙酮酸）酶2CO2+C2H5OH2C3H6O3无氧呼吸1.场所：细胞质基质2.总反应式：C6H12O6C6H12O6酶酶2CO2+C2H5OH+2ATP2C3H6O3+2ATP(能量只来自第一阶段)光合作用与呼吸作用的区别：光合作用呼吸作用原料CO2、H2OO2、葡萄糖等有机物产物O2、葡萄糖等有机物CO2、H2O等能量转换贮藏能量的过程光能→活跃的化学能→稳定的化学能释放能量的过程稳定的化学能→活跃的化学能发生部位有叶绿体的细胞、叶绿体线粒体、细胞质基质发生条件光照下才可发生光下、暗处都可发生瓦氏呼吸仪工作原理及本探索侧重点本实验设计了有光和无光两种实验条件：意图探索种子萌发进程的光合作用和呼吸作用的相对强弱、光合作用及呼吸作用的启动及调控模式。

瓦氏呼吸仪工作的基本原理：在一个密闭的定温定体积的系统中，进行样品中气体变化的测定。气体被吸收时，气体分子减少，则压力降低，气体被释放时，则压力上升，此压力变化可以在测压计上表现出来。由此可以计算气体产生或者吸收的量及速率。呼吸仪装置图T三通活塞F反应瓶C中央管S侧管R储液囊K螺旋夹M压力计的定点h压力计左右臂间的液面差

实验仪器与试剂一、仪器瓦氏呼吸计：压力计和反应瓶、恒温水槽和摇动装置其他：烧杯（50ml）、镊子、滤纸、电子天平、量筒（10ml）、移液枪（1ml）、橡皮筋、凡士林、棉花、注射器、乳胶管、钳子。二、试剂Brodie氏溶液（Nacl23g+牛胆酸钠5g+染料（100mg甲烯蓝）+1-2粒溴百里香酚蓝溶液+水=500ml）20%KOH溶液100ml洗液：重铬酸钾方法步骤材料准备：取1粒黑豆种子，用滤纸吸干水，在电子天平上称重，记录（w1）取1粒黑豆种子，用10%草酸煮沸30min，用滤纸吸干水分，在电子天平上称重，记录（w2）用排水法测体积，记录体积（Vw1和Vw2）。每组两管，分别将将黑豆种子和死黑豆放入反应瓶中，加水，使水与种子总体积为3ml，水面高于种子；在中央小管中加入0.3mlKOH溶液，用棉球把口上KOH溶液擦干净，防止KOH溶液沾到种子上。在KOH溶液中放入一小片滤纸，增加CO2吸收面积。放置黑豆的设备是测试组，放置死黑豆的是温控计组。方法步骤数据记录与处理用凡士林将各连接处的磨砂涂好，反应瓶连在压力计上，橡皮圈固定。将压力计固定在振荡板上，反应瓶浸入水中三分之二，检查各接口是否连接严密，不能漏气。打开压力计活塞，振荡30min，以使反应瓶内外温度达到平衡。调节压力计右侧的液面达到150mm处，准确记下压力计左侧液面的高度，记为初始数据。关闭三通活塞，记下时间，每隔10min记录一次双侧的数据。计数方法：在设备摇动过程中随时用压力计下的螺旋夹调整压力计封闭侧的液柱在零点（150mm）附近。读数时迅速调节压力计的封闭侧液面高度达到零点（150mm），记录开放臂压力计的液面位置实验完毕后，先打开压力计活塞，使反应瓶和外界相通，然后取下压力计和反应瓶，防止压力计内的液体倒吸入反应瓶内。取下反应瓶，倒掉种子，用水清洗，再用乙醇溶液清洗压力计和反应瓶。

瓦氏呼吸仪数据处理K=（273×Vg÷T+Vf×a）÷P0K是反应瓶常数Vg是反应瓶中气体体积，包括连接管到压力计中所取零点的一段空间（ul）Vf反应瓶中液体的体积a反应瓶内液体中的气体的溶解系数T反应瓶的绝对温度P0标准大气压10,000（Brodie液柱）思考题1）瓦氏呼吸仪测试时反应瓶总体积是12.616mL，反应瓶中液体总体积是3.20mL，20℃时氧气在水中的溶解系数是0.031，计算该反应瓶的氧气常数。2）暗反应时，反应瓶中央小管加入KOH溶液吸收种子萌发释放的CO2，平衡反应体系后，封闭反应体系的右侧气路，阐述此时将产生的液压计液面变化现象。种子萌发前后DNA、RNA的提取及含量测定目的要求

学习和掌握从植物组织中提取核酸的原理和操作技术；了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点；学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法。核酸是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分；按化学组成可以将核酸分成两大类：

①含脱氧核糖核酸（DNA）；

②含核糖核酸（RNA）；在生物体中核酸以结合成核蛋白的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。核酸的分布：细胞核、线粒体、叶绿体、核糖体、游离核酸分离、纯化原则在生物体中核酸以结合成核蛋白的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。①保持核酸分子一级结构的完整性

意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。②排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染；③无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应去除RNA分子）。注意：在低温下进行操作；减少物理因素对核酸的机械剪切力；防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围（pH值5-9），并要保持一定离子强度；防止核酸的生物降解；细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。1、RNA的提取与测定RNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。常见方法（依据RNA的种类和来源）：①苯酚法（实验室最常用的方法）

②去污剂法③盐酸胍法苯酚法：组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。优点：较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。工业提取RNA的方法酵母细胞富含RNA，是工业上提取RNA的主要原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的浓盐法或稀碱法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺较简单。浓盐法：使用10％氯化钠的溶液，同时在90摄氏度热处理3-4小时，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。经冷却，离心后上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法：使用0.2％氢氧化钠裂解酵母，然后用酸中和，除去蛋白和菌体，上清液用乙醇沉淀RNA，或调体系pH值至RNA的等电点PI2.5，沉淀目的样品。工业提取RNA的方法原理：1）动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开；2）植物组织含有大量的多酚类植物色素，它们与核酸结合能力较强且易于氧化，在核酸分离进程中需要抑制植物色素的氧化对它们进行分离。方法：先用研钵将植物细胞破碎成粉末，再用0.14mol/L氯化钠溶液把细胞中的RNP提取出来，最后用酚将RNA和蛋白质分开。本实验提取RNA的原理及方法RNA提取匀浆：称取2g干燥种子（干燥萌发种子）放置在研钵中，加入2ml的5%PVP，迅速将种子破碎研磨成粉末，粉末迅速转移到离心桶中，用10ml预冷的核分离buffer辅助粉末转移，在离心管内摇匀粉末，0℃下放置10min；离心：匀浆后4℃下，溶液离心8000r/min（RCF？）离心7分钟，量取上清液做RNA分离（体积？），沉淀物留做提取DNA（质量？）；除杂质：于上清液中加入等体积80％苯酚溶液（操作注意），搅拌充分混合10-15分钟，置冰箱冷却静止10-15分钟，离心取含有RNA上层水相（颜色？），弃下层酚相（颜色？）（操作注意）；沉淀RNA：取上层水相含RNA溶液（体积？），加入2倍体积95％冷乙醇，搅拌（操作注意），充分混合，置冰箱中冷却(约10-15分钟)，至出现白色絮状物—RNA，8000r/min离心7分钟，取沉淀物；溶解：用少量去离子水（约2毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量。浓度测定：RNA样品溶液用去离子水稀释至适当浓度，利用紫外-可见分光光谱仪检测样品在240-400nm区域的光谱信号，使得OD260在0.2-0.6之间，计算OD260/OD280值。利用公式RNA浓度=40×（OD260-OD280）×稀释倍数测样品的RNA浓度，计算样品中的RNA质量百分含量（RNA质量×100÷种子质量%）RNA含量测定方法测定RNA含量的方法：紫外吸收法、定磷法、地衣酚；地衣酚测定

原理：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与3.5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，RNA浓度在10~100μg/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。核酸浓度：

ssRNA浓度（μg/mL）=40×（OD260-OD280）×稀释倍数

ssDNA浓度（μg/mL）=33×（OD260-OD280）×稀释倍数

dsDNA浓度（μg/mL）=50×（OD260-OD280）×稀释倍数其中纯的DNA样品其OD260/OD280大于或等于1.8当值大于1.9说明有RNA污染，小于1.6说明有蛋白质或者酚类污染；纯的RNA样品其OD260/OD280大约为2当比值在1.7-2.0之间可以说明RNA较纯，当比值小于1.7说明RNA受到蛋白质或者酚类污染，比值大于2.0说明RNA受到异硫氰酸污染。OD260/OD230用于估计样品的除盐程度OD260/OD230小于2.0说明除盐不充分，需要进一步做70%乙醇洗涤。紫外吸收法在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物―钼蓝。

H3PO4+12H2MoO4→H3P(Mo3O10)4+12H2O↓还原剂

钼蓝钼蓝最大的光吸收在650-660nm波长处。当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为1-10微克磷。定磷法思考题RNA提取方法有几种？有什么优缺点？RNA提取过程中应注意什么？植物核酸提取需要注意的事项是什么？DNA的提取及含量测定在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA；微生物中，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%~10%。本实验：将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。去除蛋白的常用方法变性剂法：用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA；苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和，可以得到较好的DNA制品；氯仿法：用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来。DNA的提取溶解：将离心后除去RNA的沉淀(质量？)，用10ml的65℃预热的2×CTABbuffer和5ml2%的DTT溶解，制成悬浊液，65℃水浴中保温50min，每10min振摇离心管一次，使反应体系混合均匀，保温后将反应体系静置、自然降温至室温；除杂质：加等体积的苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）混合液，充分震荡10分钟，8000r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中（离心管）（现象？），加同体积的苯酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）混合液，重复上次操作（现象？）。直至界面不出现蛋白凝胶为止；沉淀：准确量取上清液体积，

加入1/10体积3mol/LNaAC溶液，加2倍体积95％冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000r/min离心7分钟，得白色沉淀（质量？）；溶解：将沉淀物用0.1mol/LNaOH约10毫升溶解。浓度测定：RNA样品溶液用去离子水稀释至适当浓度，利用紫外-可见分光光谱仪检测样品在240-400nm区域的光谱信号，使得OD260在0.2-0.6之间，计算OD260/OD280值。利用公式DNA浓度=50×（OD260-OD280)×稀释倍数测样品的RNA浓度，计算样品中的RNA质量百分含量（DNA质量×100÷种子质量%）DNA含量测定方法二苯胺法：

DNA分子中的2-脱氧核糖在酸性环境中变成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（λmax=595nm）。DNA在40~400微克范围内，光吸收值与DNA的浓度成正比。乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。样品中含有少量RNA并不影响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰DNA定理。思考题按照实验操作流程图，说明每一步操作的实验目的、现象、原理和进一步操作的依据。评价DNA、RNA纯度的方法提取植物DNA、RNA的关键步骤有那些工艺图2g种子+2mL5%PVP研磨+10ml核分离buffer悬浮

0℃，静置,10min

离心8000r/min,8min

等体积80％苯酚搅拌10-15min，冰箱静置10-15min8000rn/min，7min上清RNA、多糖沉淀DNA、蛋白加2倍体积95％冷乙醇冰箱至出现白色沉淀离心沉淀离心冰箱至出现白色沉淀加2倍体积95％冷乙醇等体积苯酚-氯仿-异戊醇溶液，振摇10min，离心取上清65℃保温50min，每10min振摇一次10mL65℃预热的2×CTAB+5mL2%DTT上清DNARNA加1/10体积3MNaAc种子萌发前后蛋白质的提取及含量测定蛋白质含量测定方法双缩脲法、Bradford法、Lowry法（Folin-酚法）、凯氏定氮法、紫外吸收法双缩脲法测蛋白含量实验原理在碱性溶液中，Cu2+可与肽键中失去了质子的氮原子形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关。脂类和色素对此反应有干扰，可以用四氯化碳消除干扰。硫酸铵、Trisbuffer和某些氨基酸可以干扰实验。实验需要10分钟左右，用于蛋白含量的快速测定，灵敏度不高，线性范围1-20mg。本实验采取双缩脲法测定蛋白浓度。Bradford法实验原理在酸性溶液中考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，溶液颜色从红色转变为蓝色，吸收峰从460nm转为595nm。优点是反应时间短，染料-蛋白结合温度颜色温度，抗干扰性强。缺点是不同蛋白与染料结合能力不同，目的蛋白与标准蛋白相差较大时无法准确使用。triton×100、SDS和0.1M的NaOH干扰实验测定灵敏度最高1-5mg，快速5-15分钟。BCA（Bicinchoninicacid）法碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原成Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定该络合物在562nm的吸收值，并与标准曲线对比可以计算蛋白浓度不受绝大多数化学物质的干扰，SDS、TritonX-100、Tween不影响实验结果但是螯合剂（如，EDTA），还原剂（DTT、巯基乙醇）和脂类会干扰实验结果线性范围10-2000ug/mlLowry法（Folin-酚法）蛋白质中所含肽键在碱性条件下与铜络合成紫红色化合物（双缩脲反应），同时肽链打开，蛋白质中的半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸可以使钨酸、钼酸失去1个、2个或者3个氧原子，还原成混合酸，呈现出蓝紫色（最大吸收峰在740-750nm），颜色深浅与蛋白含量成正比，于此同时，蛋白质肽键发生烯醇化反应，钼离子可以螯合在肽结构中增大酚试剂对蛋白的灵敏度。灵敏度高大约5mg，速度慢需要40-60分钟蛋白氨基酸组成不同时，方法的显色能力不同Trisbuffer、甘氨酸、各种硫醇干扰实验测定凯氏定氮法灵敏度高使用与0.2-1.0mg氮，误差为2%，需要8-10小时将蛋白氮转化为氨，干扰少、时长紫外吸收法实验原理蛋白质中酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸含有共轭双键，它们使得蛋白质呈现280nm处的特征吸收，蛋白质在238nm处的光吸收值与肽键含量成正比。优点：快速、不损失样品，生化制备中常用的缓冲盐不影响测定缺点：准确性差，干扰因素多（碱基、pH）线性范围0.1-1.0mg，快速5-10min一般用于柱层析后的蛋白浓度测定单纯蛋白OD280/OD260约为1.8；单纯核酸OD280/OD260大约为0.5。含核酸的蛋白样品浓度测定C=1.45OD280-0.74OD260(mg/ml)蛋白样品浓度测定C=0.75OD280(mg/ml)蛋白稀溶液C=0.144(OD215-OD225)(mg/ml)此时0.1MNaOH、0.1MHAc、琥珀酸、邻苯二甲酸、苯巴比妥对实验结果有影响，可以测定20-100mg/ml的样品样品制备称取0.5g种子（萌发种子），利用研钵研磨成粉末，将干粉放置于预先清洗并干燥的100ml锥形瓶内，加入1ml四氯化碳和10ml的0.05M氢氧化钾，剧烈振荡。再向锥形瓶内加入40ml双缩尿试剂（用封口膜密封锥形瓶），剧烈振荡10min后室温静置1小时。取适量放置过的反应液于离心管内，8000rpm离心10min，离心后试管内的上清液作为样品溶液等待与标准曲线样品共同测试。样品静置1小时期间进行标准曲线样品准备，样品与标准样品同时测定OD540标准曲线制备标准蛋白曲线种子萌发种子管号01234567蛋白标准液10mg/ml00.20.40.60.81.000待测液0000002.52.5水10.80.60.40.202.52.5显色剂4444440025摄氏度30minOD540计算样品中蛋白质的质量百分含量（蛋白质质量×100÷种子质量%）思考题阐述蛋白质浓度测定方法及其优缺点双缩脲法、BCA法显色机制的差异紫外吸收法鉴定蛋白质纯度及检测蛋白质浓度的理论依据双缩脲法测蛋白浓度的注意事项种子萌发前后糖的提取及含量测定糖含量检测方法硫酸蒽酮法硫酸苯酚法DNS比色定糖法（还原糖）菲林试剂定糖法（还原糖）硫酸蒽酮法反应原理糖在浓硫酸的作用下，经脱水反应生成糠醛或者羟甲基糠醛，糠醛和羟甲基糠醛可以与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内颜色深浅与糖含量成正比。该反应可以测试戊糖、己糖、所有寡糖类和多糖类，可以测溶液中全部可溶性碳水化合物总量但是此方法针对不同的糖显色程度不同，果糖显色要依次高于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、五碳糖。缺点是显色不稳定，需要20min内测完。硫酸苯酚法实验原理糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或者羟甲基糠醛可以与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10-100mg浓度范围内，OD485与糖含量成正比。主要用于测试可溶于水或者乙醇的甲基化糖、戊糖和多聚糖。优点是显色稳定，灵敏度高。DNS法碱性条件下加热时，体系内的还原糖经氧化生成糖酸及其他产物，3,5-二硝基水杨酸同时经还原生成棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸，在一定范围内OD540与糖浓度成正比。有醛基或酮基的糖是还原糖，单糖都是还原糖，二糖或者多聚糖不一定是还原糖。样品制备第一天取2g种子（萌发种子），利用研钵研磨成粉末，利用90ml去离子水将粉末转移到磨口圆底烧瓶，60℃下回流2小时，静置自然冷却到室温；8000rpm离心8分钟，将上清转移到100ml容量瓶，用去离子水定容到100ml；取10ml样品放置在200ml锥形瓶内，加入150ml无水乙醇，4℃过夜静置。第二天8000rpm离心15min，弃上清，沉淀用去离子水溶解，定容至100ml硫酸蒽酮法测定糖含量标准糖曲线种子萌发种子管号123456789糖标准液0.1mg/ml00.20.40.60.81.01.200待测液00000002.0