神经生物学实验课件

脑立体定位和切片技术脑立体定位和切片技术脑立体定位技术脑立体定位技术脑立体定位技术的简单流程脑立体定位技术的简单流程动物脑立体定位：

利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神经结构的位置，利用脑立体定位仪对脑进行定向的刺激、破坏、药物注射、引导电位等研究的技术。主要用途：

对神经结构进行定向的：注射（给药）

埋管（慢性给药，透析）

损毁

记录（电生理）动物脑立体定位：

利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神前囟（Bregma）：位于冠状缝和矢状缝的交界处人字缝尖（lambda）：位于后囟人字缝与矢状缝的交汇点前囟（Bregma）：位于冠状缝和矢状缝的交界处Bregma,前囟Bregma,前囟动物脑立体定位：

利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神经结构的位置，利用脑立体定位仪对脑进行定向的刺激、破坏、药物注射、引导电位等研究的技术。主要用途：

对神经结构进行定向的

注射（给药）

埋管（慢性给药，透析）

损毁

记录（电生理）动物脑立体定位：

利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神Kopf900StereotaxicKopf1404FrameAssembly立体定位仪：Kopf900StereotaxicKopf1404StereotaxicDrillUnitAdjustableWireKnifeKopf5000MicroinjectionUnitStereotaxicDrillUnitAdjustab立体定位仪：立体定位仪：游标卡尺原理根据游标上的分度格数，常把游标卡尺分为10分度、20分度、50分度。尺身上的最小分度是1毫米，游标尺上有10个小的等分刻度，总长9毫米，每一分度为0.9毫米，比主尺上的最小分度相差0.1毫米。尺身和游标的零刻度线对齐，它们的第一条刻度线相差0.1毫米。立体定位仪中坐标的读取主尺游标尺游标卡尺原理立体定位仪中坐标的读取主尺游标尺游标卡尺按下列规则读数：（1）以游标零刻线位置为准，在主尺上读取整毫米数。（2）看游标上哪条刻线与主尺上的某一刻线（不用管是第几

条刻线）对齐，由游标上读出毫米以下的小数。（3）总的读数为毫米整数加上毫米小数。游标卡尺按下列规则读数：研究实例研究实例MFB:(1)AP:­4.4mm,ML:1.2mm,V:­7.8mm;

(2)AP:­4.0mm,ML:0.8mm,V:­8.0mm内侧前脑束（MFB）:从基底嗅区、旁杏仁核区和隔核出发投射至下丘脑侧部的一组复杂纤维。MFB的DA能神经纤维相对集中，相对小剂量的6-OHDA注入MFB能造成更多的DA能神经元死亡。MFB:(1)AP:­4.4mm,ML:1.2[器材和药品]立体定位仪、10％水合氯醛麻醉剂、1ml注射器、手术刀、组织剪、止血钳、牙科钻或骨钻、金属定位针、脱脂棉花、3%双氧水（H2O2）、缝针与缝线、75%酒精[实验动物]雄性SD大鼠，体重约200-300g实验准备[器材和药品]实验准备[操作步骤]1.立体定位仪的一般校验2.动物麻醉：动物称重后，水合氯醛溶液按3.6ml/kg作腹腔注射麻醉。3.

头部固定：（1）插入耳棒:先将一侧耳棒轻轻插入外耳道，碰到骨性外耳道底后固定耳棒，继之同样固定另一耳棒。检查大鼠头部固定是否稳定，松斜，两侧耳棒刻度是否对称，轻移耳棒使两侧刻度一致，头位完全居中，再次固定耳棒。

三个标准检测是否固定成功：鼻对正中，头部不动，提尾不掉

（2）固定上颌：将大鼠的上门牙塞进上齿固定板的槽内，旋紧螺丝。从各方向推压动物头部，均不应出现移动。

通过定位针的测量调节前后囟在同一矢状线上，并使前后囟在同一水平线上。

[操作步骤]4.开颅：剪去头部的毛，用碘酒与酒精棉球消毒头部皮肤，沿矢状缝作切口，剥离筋膜及肌肉，推开骨膜，暴露骨缝，并用3%双氧水洗净，止血。5.脑内核团定位:(1)根据脑图谱，确定所要研究神经核团的立体位置（注意：所研究的脑核团距脑表面的距离和颅骨表面的距离）。

(2)用定位针参照中线和前后囟在颅骨上标记进针的部位后，在指定位置钻孔。6.定位标记及组织学鉴定：

(1)定位标记：根据定位坐标，插入微量注射针，注入染料。

(2)组织学鉴定：

动物处死后，大鼠用左心室-主动脉插管，先后用生理盐水和4%多聚甲醛溶液灌流固定，取脑作冰冻连续切片，观察确定注射位置是否准确4.开颅：剪去头部的毛，用碘酒与酒精棉球消毒头部皮肤，沿矢神经生物学实验课件神经生物学实验课件纹状体：前囟前1mm,旁开2.5mm,深3.5mm1.00实验内容纹状体：前囟前1mm,旁开2.5mm,深3.5m切片技术切片技术固定剂:

理想的固定剂应能阻止组织自溶，保护组织免受微生物的作用，并能使组织承受一定的渗透压的作用，维持组织结构的完整；能保存或至少部分保存组织的化学特性。常用的固定剂-----醛类。甲醛（formaldehyde）是醛类中最常用的;商品名为福尔马林（formalin）的试剂，约含37%的甲醛。4%多聚甲醛（paraformaldehyde）也是常用的固定剂，在热水中可解聚为成甲醛单体，在接近水的沸点时溶解极快。戊二醛（glutaraldehyde）也是一种常用的固定剂。它的交链作用较甲醛强，反应快，但其对组织的穿透力较甲醛弱。切片的制备：固定固定剂:切片的制备：固定切片方法：振动切片、石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片

切片（Sectioning）4μm30μm恒冷切片机冰冻切片机冰冻切片：是神经形态学研究中常用的方法

最主要的优点：快速简便

恒冷切片机切片和半导体制冷机切片脑片厚度：10~100微米切片方法：振动切片、石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片切片（[器材和药品]

器械：手术刀、组织剪、止血钳、咬骨钳、无齿钳、5ml注

射器、6号针头、灌注瓶、恒冷切片机/半导体制冷切

片机

液体：10％水合氯醛溶液、生理盐水、4％多聚甲醛溶液、20％蔗糖溶液、30％蔗糖溶液制备切片具体步骤：[器材和药品]制备切片具体步骤：[操作步骤]1.麻醉动物：在无需特别考虑麻醉药影响的情况下，可深麻动物。2.组织固定：决定切片的质量

固定方式－－浸泡固定和灌注固定灌注固定(1)剪开胸腔，暴露心脏(2)将注射针头插入左心室，减开右心耳(3)放松输液管夹，先用生理盐水冲去血液，直至右心耳流出液体清亮无色（一般原则灌洗量不宜过多，灌洗时间不宜长，大鼠一般100ml）(4)换以固定液继续灌流，先快后慢，固定液的量，大鼠一般为300-500ml左右(5)开颅取脑，后固定、入蔗糖→切片生理盐水4%PA[操作步骤]固定方式－－浸泡固定和灌注固定灌注固定生理盐水43.切片※切片刀的安置：刀的刃面与组织切面之间应有一定的角度，称为余隙角a。余隙角一般在2~5

※组织冷冻程度：

冷冻适度，过冷可致切片横向断裂、冷冻不足，切片容易厚薄不匀※切片：

动作连贯3.切片切片中常遇到的问题及解决方案：切片中常遇到的问题及解决方案：半导体制冷仪半导体制冷仪每次写实验报告，交给下次上实验课的老师。记平时成绩（占最后总成绩的20％）下次实验课：时间：10月10日，星期六，上午九点开始

地点：治道楼八楼会议室

上课内容为：免疫组织化学ABC染色法每次写实验报告，交给下次上实验课的老师。记平时成绩Thanks!Thanks!脑立体定位和切片技术脑立体定位和切片技术脑立体定位技术脑立体定位技术脑立体定位技术的简单流程脑立体定位技术的简单流程动物脑立体定位：

利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神经结构的位置，利用脑立体定位仪对脑进行定向的刺激、破坏、药物注射、引导电位等研究的技术。主要用途：

对神经结构进行定向的：注射（给药）

埋管（慢性给药，透析）

损毁

记录（电生理）动物脑立体定位：

利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神前囟（Bregma）：位于冠状缝和矢状缝的交界处人字缝尖（lambda）：位于后囟人字缝与矢状缝的交汇点前囟（Bregma）：位于冠状缝和矢状缝的交界处Bregma,前囟Bregma,前囟动物脑立体定位：

利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神经结构的位置，利用脑立体定位仪对脑进行定向的刺激、破坏、药物注射、引导电位等研究的技术。主要用途：

对神经结构进行定向的

注射（给药）

埋管（慢性给药，透析）

损毁

记录（电生理）动物脑立体定位：

利用颅骨的标志/参考点，确定皮层下某些神Kopf900StereotaxicKopf1404FrameAssembly立体定位仪：Kopf900StereotaxicKopf1404StereotaxicDrillUnitAdjustableWireKnifeKopf5000MicroinjectionUnitStereotaxicDrillUnitAdjustab立体定位仪：立体定位仪：游标卡尺原理根据游标上的分度格数，常把游标卡尺分为10分度、20分度、50分度。尺身上的最小分度是1毫米，游标尺上有10个小的等分刻度，总长9毫米，每一分度为0.9毫米，比主尺上的最小分度相差0.1毫米。尺身和游标的零刻度线对齐，它们的第一条刻度线相差0.1毫米。立体定位仪中坐标的读取主尺游标尺游标卡尺原理立体定位仪中坐标的读取主尺游标尺游标卡尺按下列规则读数：（1）以游标零刻线位置为准，在主尺上读取整毫米数。（2）看游标上哪条刻线与主尺上的某一刻线（不用管是第几

条刻线）对齐，由游标上读出毫米以下的小数。（3）总的读数为毫米整数加上毫米小数。游标卡尺按下列规则读数：研究实例研究实例MFB:(1)AP:­4.4mm,ML:1.2mm,V:­7.8mm;

(2)AP:­4.0mm,ML:0.8mm,V:­8.0mm内侧前脑束（MFB）:从基底嗅区、旁杏仁核区和隔核出发投射至下丘脑侧部的一组复杂纤维。MFB的DA能神经纤维相对集中，相对小剂量的6-OHDA注入MFB能造成更多的DA能神经元死亡。MFB:(1)AP:­4.4mm,ML:1.2[器材和药品]立体定位仪、10％水合氯醛麻醉剂、1ml注射器、手术刀、组织剪、止血钳、牙科钻或骨钻、金属定位针、脱脂棉花、3%双氧水（H2O2）、缝针与缝线、75%酒精[实验动物]雄性SD大鼠，体重约200-300g实验准备[器材和药品]实验准备[操作步骤]1.立体定位仪的一般校验2.动物麻醉：动物称重后，水合氯醛溶液按3.6ml/kg作腹腔注射麻醉。3.

头部固定：（1）插入耳棒:先将一侧耳棒轻轻插入外耳道，碰到骨性外耳道底后固定耳棒，继之同样固定另一耳棒。检查大鼠头部固定是否稳定，松斜，两侧耳棒刻度是否对称，轻移耳棒使两侧刻度一致，头位完全居中，再次固定耳棒。

三个标准检测是否固定成功：鼻对正中，头部不动，提尾不掉

（2）固定上颌：将大鼠的上门牙塞进上齿固定板的槽内，旋紧螺丝。从各方向推压动物头部，均不应出现移动。

通过定位针的测量调节前后囟在同一矢状线上，并使前后囟在同一水平线上。

[操作步骤]4.开颅：剪去头部的毛，用碘酒与酒精棉球消毒头部皮肤，沿矢状缝作切口，剥离筋膜及肌肉，推开骨膜，暴露骨缝，并用3%双氧水洗净，止血。5.脑内核团定位:(1)根据脑图谱，确定所要研究神经核团的立体位置（注意：所研究的脑核团距脑表面的距离和颅骨表面的距离）。

(2)用定位针参照中线和前后囟在颅骨上标记进针的部位后，在指定位置钻孔。6.定位标记及组织学鉴定：

(1)定位标记：根据定位坐标，插入微量注射针，注入染料。

(2)组织学鉴定：

动物处死后，大鼠用左心室-主动脉插管，先后用生理盐水和4%多聚甲醛溶液灌流固定，取脑作冰冻连续切片，观察确定注射位置是否准确4.开颅：剪去头部的毛，用碘酒与酒精棉球消毒头部皮肤，沿矢神经生物学实验课件神经生物学实验课件纹状体：前囟前1mm,旁开2.5mm,深3.5mm1.00实验内容纹状体：前囟前1mm,旁开2.5mm,深3.5m切片技术切片技术固定剂:

理想的固定剂应能阻止组织自溶，保护组织免受微生物的作用，并能使组织承受一定的渗透压的作用，维持组织结构的完整；能保存或至少部分保存组织的化学特性。常用的固定剂-----醛类。甲醛（formaldehyde）是醛类中最常用的;商品名为福尔马林（formalin）的试剂，约含37%的甲醛。4%多聚甲醛（paraformaldehyde）也是常用的固定剂，在热水中可解聚为成甲醛单体，在接近水的沸点时溶解极快。戊二醛（glutaraldehyde）也是一种常用的固定剂。它的交链作用较甲醛强，反应快，但其对组织的穿透力较甲醛弱。切片的制备：固定固定剂:切片的制备：固定切片方法：振动切片、石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片

切片（Sectioning）4μm30μm恒冷切片机冰冻切片机冰冻切片：是神经形态学研究中常用的方法

最主要的优点：快速简便

恒冷切片机切片和半导体制冷机切片脑片厚度：10~100微米切片方法：振动切片、石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片切片（[器材和药品]

器械：手术刀、组织剪、止血钳、咬骨钳、无齿钳、5ml注

射器、6号针头、灌注瓶、恒冷切片机/半导体制冷切

片机

液体：