小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养2013

细胞工程综合实验报告小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养TOC\o"1-5"\h\z班级 XXXX姓名 XXXX学号 XXXXXXXXXX指导教师 XXXX实验时间 XXXX成绩 小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养姓名学号班级一、实验目的了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。初步掌握培养过程中的无菌技术。了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。肾脏细胞:所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰酶消化能出去间质，使组织松散成单个细胞或小的细胞团，细胞易于生长。三、主要试剂小鼠1只、PRMI1640培养基、胰蛋白酶和EDTA、PBS缓冲液、青霉素、链霉素、75%酒精、蒸馏水四、仪器设备解剖盘、镊子、剪子、手术刀、盖玻片、吸管、显微镜、无菌操作台、5ml注射器、注射针、试管、培养瓶等。二氧化碳培养箱、生物显微镜、高速冷冻离心机、低温冰箱五、实验步骤溶液的配置小鼠腹腔巨噬细胞原代培养1、 以颈椎脱臼法处死小鼠。2、 手提鼠尾将其全浸入75%乙醇中10s,倒立小鼠并向腹腔内注射预冷至培养液5ml（注意针尖勿伤及内脏），仰卧平放并轻揉小鼠腹部2〜3min，静置5〜7min。3、 置小鼠于解剖台,用针头固定四肢,在腹股沟区作一横切口,撕裂皮肤以完全暴露出腹膜壁，但勿伤及腹膜壁。4、 用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动，并促使巨噬细胞从腹腔的浆膜表面释放，形成细胞悬液。5、 用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧．使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。6、 小心拔出针头，把腹腔液注入离心管中。7、 将细胞悬液于4°C、1000r/min离心5min,弃上清，取3ml的加双抗的培养基进行吹打，放入培养瓶中，再在培养瓶中加入2ml的培养基。8、 将拧紧口的细胞培养瓶放进CO培养箱中，然后，将瓶口松1.5圈（保证细胞呼吸），2平放着混匀细胞，过夜培养。9、 第二天进行细胞换液；第三天观察细胞生长情况并拍照。肾脏细胞的原代培养1、用品消毒后，安放在超净工作台内，紫外线消毒，做好洗手等准备工作。2、点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等3、取材取新生乳鼠一只，采用颈椎脱臼法处死，然后把这个小鼠入盛有75%酒精的烧杯中10秒，随即携入超净工作台内。在超净工作台内取出小鼠，置于消毒培养皿中打开消毒器械包用镊子掀起乳鼠腹部皮肤，用解剖剪剪开腹腔，充分暴露腹腔，用另一镊子轻轻夹起肠管，翻置一侧，充分暴露位于腹腔背壁脊柱两侧的肾脏取下双侧肾脏，放入消毒培养皿中（去除肾盂、肾门和肾外表皮）用吸管吸取PBS加入培养皿中，清洗肾脏3次，尽量去掉血污再将肾组织用解剖剪剪成几块再用PBS漂洗，去净血液为止。4、消化将洗净的组织块移入消毒小瓶中（如毒霉素瓶）用眼科剪深入瓶内反复剪切组织直至lmm3大小的组织块加入5-8倍量（体积）的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37C细胞培养箱中消化30分钟，注意应每隔10分钟振摇一次。当组织块变得疏松，颜色略白时，取出置于超净工作台内静置后用吸管吸去上清，加入一定量的培养液终止消化，反复吹打组织块，使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态，让未消化完的组织块自然下沉，将上部的组织悬液移入消毒离心管中离心。5、离心离心管平衡后，以1000转/分离心10分钟，超净工作台内开盖，吸取上清液加入5ml培养液，盖盖，注意应有空隙，标明细胞名称，代数，日期，将培养瓶置于37C细胞培养箱中过夜培养。6、第二天进行细胞换液；第三天观察细胞生长情况并拍照。六、实验结果小鼠巨噬细胞（六）小鼠肾脏细胞（六）七、分析和讨论由以上实验结果可知，我组的实验很成功（基本上掌握了本次实验涉及的所有技术）。培养生长出来了较多较大的巨噬细胞，可以清晰地看到一粒粒的梭形巨噬细胞呈现在眼前，非常的清楚明了，甚至可以作为标本。说明此次巨噬细胞的培养特别成功当然也得到了一定量的肾脏细胞，只是相对来说比较明显的肾脏细胞的量较少，且只看到了一个。分析原因：液体培养基在分装过夜处理时可能是染菌了，不能用来进行小鼠细胞的培养，只能借助于其他组的，其次在操作过程中也损失了部分肾脏细胞。八、心得体会1、细胞实验操作的实验要求要无菌操作尽量避免感染杂菌。2、本次实验的过程设计由我们各组自己查阅文献制定具体方案，所以，我们在操作过程中更能知道实验中每一个步骤的原理和目的，收获更大。3、为了防止器皿表面的杂菌污染里面的细胞或培养液，在开盖前，先用75%的酒精擦拭瓶盖