2022年医学专题-、内毒素检查法在药品生产质控的应用修改

细菌内毒素检查(jiǎnchá)在药品生产质控上的应用冯聚锦湛江安度斯生物(shēngwù)2021年3月第二稿第一页，共三十九页。一、鲎试验对药品(yàopǐn)生产质控的意义药品生产企业实施GMP的意义在于使人们对药品质量的控制从传统的成品检验，上升到对药品生产全过程进行有效监控的现代质量管理模式。美国食品及药物监督管理局〔FDA〕自2004年起大力(dàlì)推行“过程分析技术〞(ProcessAnalyticalTechnology,PAT)，更凸显了医药兴旺国家对药品生产过程质控的高度重视。第二页，共三十九页。2在医药工业的GMP条件下，“热原就是内毒素，控制内毒素就控制了热原〞已成为共识。基于这种认识，许多国家的药典(yàodiǎn)已由细菌内毒素检查项取代热原检查项并且成为了开展的趋势，将会有越来越多的药典(yàodiǎn)品种使用鲎试剂检查。不仅如此，鲎试验法在医药工业上目前是注射药品生产质控的最好方法，它为众多的药品生产企业带来显著的经济效益。第三页，共三十九页。3

中国和美国是世界上应用鲎试剂最早的国家，也是鲎试剂产量及用量最多的国家。尽管如此，两国在鲎试剂应用的水平(shuǐpíng)、程度及范围上仍有明显的差异。中国药典2005年版收载的BET品种有160多种，而USP收载的BET品种超过700种。70%＜30%生产质控应用领域的比较30%3%30%25%42%美国＞70%—

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—5%＞90%中国终产品检验终点显色动态显色动态浊度凝胶法方法学应用的比较在医药兴旺国家，一个注射药品生产体系的建立或GMP认证，都要求在生产质控上应用鲎试验方法。我国目前(mùqián)的GMP认证还没有这方面的要求，应该说是个缺陷，但开展趋势必然会补充相应的要求。第四页，共三十九页。4二、生产质控的根本特点(tèdiǎn)及要求按控制的时机分类：事前控制：对正在生产的产品质量(chǎnpǐnzhìliànɡ)控制有效；事后控制：对正在生产的产品质量控制无效，只对以后生产的产品质量控制有效。按控制的方式分类：静态控制：对已完成的生产工序的质控无效，只对以后的生产工序的质控有效；动态控制：对正在进行或将要进行的生产工序的质控有效。第五页，共三十九页。5生产质控对检验方法的要求采样方便、微量操作简单、快速检查(jiǎnchá)准确、灵敏结果可靠，数据处理自动化鲎试验法目前是满足药品生产质控的最好方法鲎试验的优点：采样方便、微量：0.1~1ml操作简便、快速：7~60分钟灵敏、准确：最低可测0.001EU/mL的内毒素含量，定量检测的范围可涵盖0.001~1,000EU/mL。技术成熟，自动化程度高鲎试验是目前能使药品生产的热原控制实现动态监控和事前控制的唯一方法。第六页，共三十九页。6三、药品(yàopǐn)生产过程内毒素的控制方法内毒素监控体系〔1〕监控对象重要的媒体及原料(yuánliào)水是制药工业最重要的媒体，是首要的监控对象使用量大的原料生产过程添加的各种辅剂与中间体接触的各种用具、器皿及终产品的包装容器第七页，共三十九页。7各工序前后中间体内毒素水平的变化

至少在生产过程的重要工序之间要设置检测点，例 如在除热原工序后设置检测点，检测该工序除热原〔干烤、过滤(guòlǜ)、吸附〕的效果。又如在分装工序前需抽检，确保中间体内毒素水平不超出控制水平才进行分装。烘箱等除热原设备的验证第八页，共三十九页。8生产(shēngchǎn)原料生产用具(yòngjù)、容器入库(rùkù)清洗、除热原备用工序1原料分装辅剂工序2工序3终成品入库水辅剂Δ1Δ2Δ3Δ6Δ8Δ4Δ5Δ7Δ9Δ10鲎试验检查Δ1Δ2Δ3Δ内毒素检测点

工序运行路线

取样 检测结果反响〔2〕药品生产过程细菌内毒素监控体系第九页，共三十九页。9建立内毒素监控体系的步骤确定药品的内毒素限值L；分析药品生产过程，合理设置内毒素监测点；制定各监测点合理的内毒素控制水平Lx；进行干扰性验证试验确定各监测点样品的有效浓度或有效稀释范围，选择所用鲎试剂的灵敏度。进行日常(rìcháng)的内毒素监测检查。第十页，共三十九页。10内毒素控制(kòngzhì)限值确实定如果终产品的内毒素限值为L，各监测点的内毒素控制水平为LX，那么LX＜L。某些原料或中间体在其后的生产工序中将要被稀释，计算其稀释后的内毒素含量ED，如果ED＜1/4L，可以允许该原料或中间体的内毒素控制水平LX＞L。例如，某种主要原料在生产时将要被稀释10倍使用，如果L为0.5EU/ml，可以允许该原料的内毒素控制水平LX1.25EU/ml。第十一页，共三十九页。11

如果能确实保证在除热原工序后的中间体的内毒素含量少于1/4L，可允许该工序前的LX适当大于L。在制定各监控点LX时，应注意热原具有积累性。制药企业(qǐyè)需要根据自身的生产条件及工艺水平来制定合理的LX值。在欧美通常以1/10L~1/4L作为LX。第十二页，共三十九页。12

千万不要以药典的内毒素限值作为(zuòwéi)控制值

据了解，不少企业的质检人员以药典给出的该品种的内毒素限值作为产品质量的控制值或者作为产品出厂放行的合格值。这种做法其实不好，原因如下：

〔1〕药典给出的药品的内毒素限值是对药品质量的最低要求。任何有一定质量能力的企业都不应以这最低的要求作为自己产品的标准。

〔2〕细菌内毒素检查是一项生物检查，有较宽的精确范围。特别是凝胶法鲎试验，精确度只有值的50~200%，当产品的内毒素含量值接近限值时，很容易出现结果的不确定性。

〔3〕理想的产品放行值应≤1/4药典限值。2022/10/30第十三页，共三十九页。13各监控点样品的干扰验证目的(mùdì)：找出每个监测点的供试品的无干扰浓度抽取监测点的适量样品选择凝胶法鲎试剂的灵敏度或定量鲎试剂的标准曲线范围；计算检测样品的最大有效稀释倍数MVD样品与鲎试剂相容性的初筛试验；样品与鲎试剂的干扰试验第十四页，共三十九页。14干扰验证举例(jǔlì)〔凝胶法〕：

某生物制品在冷冻枯燥前的分装液〔S〕为120mg/ml,Lx<0.05EU/mg(L<0.2Eu/mg)。1〕Ls<0.05Eu/mg×120mg/ml＝6.0Eu/ml；2〕假设选用λ=0.125Eu/ml的TAL，最大有效稀释；

第十五页，共三十九页。153〕取分装液(S)用BET水作1:48倍稀释，得供试液〔S48〕；4〕取λ=0.125Eu/ml的TAL对S48作干扰试验；5〕如果干扰试验结果说明S48对BET无干扰，就把这个浓度定为S的日常监测浓度，即每批产品分装前，取S稀释成S48，用λ=0.125EU/mL的TAL作检查。如果检查结果为阳性，说明S的内毒素含量超标〔≥0.05Eu/mg〕，不能进入分装冻干工序(gōngxù)；如果检查结果为阴性，S可进行分装冻干。第十六页，共三十九页。16生产过程细菌内毒素监控的常规检查采样把样品制备成供试液(shìyè)〔如前S48〕鲎试验检查结果分析将信息反响至生产控制系统第十七页，共三十九页。17四、细菌内毒素的快速检测(jiǎncè)方法鲎试验在生产质控上应用的方法较灵活，不受药典法规(fǎguī)的限制，既可采用药典法规(fǎguī)接受的鲎试验方法，也可采用更新更先进的技术和方法。以下介绍几种有代表性的最新的快速鲎试验方法。细菌内毒素快速检测试剂盒湛江安度斯公司的创造专利属于凝胶法原理：使用高灵敏度的试剂作低灵敏度使用反响时间只需20-25分钟操作方便、简单用途：生产过程细菌内毒素的限量快速检测第十八页，共三十九页。18特点：使用方便

快速(kuàisù)检测盒内配置与国际使用接轨的单次试验鲎试剂〔TAL〕。使用这种单次试验TAL时，直接加0.2ml样品复溶试剂兼检测，不必象使用0.1ml/支TAL那样要先加0.1ml的水复溶试剂，然后再加0.1ml样品检测。第十九页，共三十九页。19同一试剂盒有多个灵敏度供选择

在每一批号的快速检测试剂盒上都标示有至少(zhìshǎo)两个可供选择的灵敏度。使用时选择不同的灵敏度(λ0)对应有不同的反响时间(T0)。如批号为0809082的快速检测试剂盒，灵敏度标示如下：λ0T00.25EU/mL20±1分钟0.125EU/mL25±1分钟第二十页，共三十九页。20CSE无需稀释

我们知道，作鲎试验最繁琐耗时的操作就是稀释标准内毒素〔CSE〕。快速检测试剂盒配备了无需稀释一步到位的CSE，使实验真正快速方便(fāngbiàn)。配套器具，得心应手

作快速鲎试验时，如果配合使用安度斯公司提供的可调移液器、采样瓶、可定时的干式恒温仪等实验器具，可真正体会到BET实验的快速、准确及方便。第二十一页，共三十九页。21名称规格数量鲎试剂（TAL）0.2ml/支λ：0.125EU/ml/0.25EU/ml8支工作标准内毒素（CSE）5EU/支1支BET水2ml/支1支试剂盒组成(zǔchénɡ)第二十二页，共三十九页。22使用(shǐyòng)方法：〔λ=0.125EU/mL〕检查项目反应管数每管加样阴性对照（溶液D）20.2mLBET水阳性对照（溶液C）20.2mLBET水+0.01mLE5供试品阳性对照（溶液B）20.2mLS+0.01mLE5

供试品（溶液A）20.2mLS第二十三页，共三十九页。23光度法定性快速检测法属动态浊度或动态显色法需要使用动态光度仪及相应软件方法及步骤1〕确定(quèdìng)供试品原液〔S0〕的内毒素限值〔L或Lx〕2〕确定供试品无干扰浓度，如S83〕制备不含可测内毒素的供试品S84〕制备含L8浓度标准内毒素的阳性供试品S8L8

第二十四页，共三十九页。245〕在日常监测时，以S8L8与TAL反响的时间T0作为判断其它(qítā)供试品内毒素含量的标准：但凡反响时间T<T0的供试品，其内毒素含量>L8，即原液S0的内毒素含量>L但凡反响时间T>T0的供试品，其内毒素含量<L8，即原液S0的内毒素含量<L；只需供试品的动态曲线一到达预设光度值，即可知道该供试品是否合格。甚至分析供试品动态曲线的走势就可知道供试品是否合格。预设(yùshè)透光度值S8L8产品(chǎnpǐn)不合格产品合格T1T0

T2S8NC100%92%RtT(秒)第二十五页，共三十九页。25光度法定量快速检测法属动态浊度法或动态显色法需要使用安度斯软件“生物探针-2002〞方法及步骤

1〕预先用标准内毒素与TAL反响(fǎnyìng)制备一条标准曲线，存档。最理想的标准曲线是用同体系模型法建立〔参阅本公司讲义2005年3月版〕；

2〕检测开始前调出存档标准曲线

3〕反响开始后，只要各供试品的动态曲线一到达预设光度值，界面上的表格中立即显示出该供试品的内毒素含量第二十六页，共三十九页。26供试品内毒素含量(hánliàng)调用的标准(biāozhǔn)曲线第二十七页，共三十九页。27本卷须知制备存档标准曲线的TAL必须与检测试剂相同；供试品应在无干扰(gānrǎo)浓度且不超过MVD浓度内检测。第二十八页，共三十九页。284、便携式检测(jiǎncè)系统——PTSPTS是美国查尔斯河实验室公司(CharlesRiverLaboratories,Inc.)最新推出的生物分析系统(xìtǒng)PTS是一种便携式、可现场使用、快速、定量的检测系统。细菌内毒素的定量快速检测仅是PTS的功能之一，其它生物测定的功能正在陆续推出。第二十九页，共三十九页。29PTS是由便携式光度仪和检测试剂(shìjì)卡两局部组成。第三十页，共三十九页。30技术原理——动态显色法鲎试验每块试剂卡中有四条反响通道如下：系统内置存档标准曲线，仪器自动测定吸光度(guāngdù)及进行数据处理。供试品

阳性对照

通道(2条)加样孔LAL显色底物CSE反应池抽吸孔供试品

检查(jiǎnchá)通道

〔2条〕第三十一页，共三十九页。31实验(shíyàn)方法开启仪器预热至37℃插入试剂卡在试剂卡的四个加样孔中各参加25l(0.025ml)供试品溶液按“检测〞键〔Enter〕约7~15分钟后屏幕上显示如下检测结果：回收率：？供试品含量：？EU/mL变异系数：CV=?%第三十二页，共三十九页。32PTS的特点使用(shǐyòng)极灵敏可靠的鲎试验技术获得美国FDA认证体积小巧，仅1公斤重，内置电源，可在任何现场使用7-15分钟可获得定量的检测结果只需极简单的操作：插入检测卡片→参加样品→自动检测并显示检测结果第三十三页，共三十九页。33无需用户建立标准曲线无外部恒温(héngwēn)孵育要求检测范围：10-0.1EUmL

5-0.05EU/mL

1-0.01EU/mL可显示样品内毒素含量、回收率、变异系数检测结果可贮存、打印或下载到电脑第三十四页，共三十九页。34

PTS的应用水制备系统(xìtǒng)的监控研发产品的检测生产现场半成品的快速检测医疗器械的质量监控——如血液透析第三十五页，共三十九页。35目前(mùqián)PTS可分析的工程细菌内