药监系统官方培训06细菌内毒素方法介绍-蔡彤

细菌内毒素检查法及干热法除热原验证标准品简介中国食品药品检定研究院化药所

药理室蔡彤2019.4中国食品药品检定研究院NationalInstitutes

rFoodandDrugControl中国食品药品检定研究院简

介凝胶法及光度测定法干热法除热原及验证标准品实验涉及内容及相关要求NationalInstitutesforFoodandDrugControl简

介•

细菌内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁的组分之一：LPS•

在细NationalInstitutesforFoodandDrugControl简

介脂多糖（LPS）•

直径约1-50nm•

平均分子量60000•

脂多糖组成：类脂A——核心多糖——特异性多糖链类脂A

：表现生物活性。核心多糖：连接类脂与特异性多糖链，由恒定的多糖组成。特性多糖链

：因菌种不同而不同3-5个多糖重复排列，决定特异性。又称o-特异性链。NationalInstitutesforFoodandDrugControl简

介•

细菌内毒素具有：u耐热性

不易灭活（180℃、2小时；250℃、30分钟）uu分子极性

易聚集、吸附，需充分混合高致热性

作用于人体，引起发热、寒颤、恶心、甚至死亡等热原反应NationalInstitutesforFoodandDrugControl热原与细菌内毒素的关系•

热原：所有能引起热原反应的物质称为热原。•

细菌内毒素只是热原的一种。不是每一种热原都具有脂多糖结构，但是所有已知的内毒素都具有热原活性。细菌内毒素热原NationalInstitutesforFoodandDrugControl热原与细菌内毒素的关系•

在GMP条件下进行药品生产和质量控制，可以接受的观点是：不存在内毒素意味着不存在热原。•

理解为：在GMP的生产条件下，细菌内毒素是热原物质的质控关键点。NationalInstitutesforFoodandDrugControl简

介•

细菌内毒素检查法检

验•

注射用药品（内毒素）防止发生•

临床热原反应Ø

安全性试验NationalInstitutesforFoodandDrugControl内毒素检查法的建立与完善发现（50年代）：1956年JohnsHophins大学动物学家Frederik.Bang发现革兰阴性细菌的粗提取物（LPS）能使鲎的血细胞凝聚。建立（60年代）：1968年.Levin和Bang用内毒素和鲎血细胞溶解物证明鲎血凝聚机制是一种

反应，并创立鲎试验（细菌内毒素检查法前身）NationalInstitutesfo细菌内毒素检查法的创始人NationalInstitutesforFoodandDrugControlDrs.FrederickB.BangandJ

kLevin内毒素检查法的建立与完善•

阐明机制（70年代）：70年代后期多位学者从分子水平阐明参与鲎血细胞凝聚机制。•

补充完善（80年代）：1981年日本学者Iwanaga发现鲎试剂中的G因子可以被真菌、酵母和藻类细胞壁中的一类细菌多糖β(1,3)-D-葡聚糖激活。而LPS则不能激活G因子旁路。NationalInstitutesforFoodandDrugControl反应原理内毒素（旁路反应）二价离子pH6.0~8.0β-葡聚糖鲎试剂美国内毒素检查法发展Ø

1973年FDA发表通告声明鲎试剂为生物制品，限于药品中间过程检验。Ø

1980年FDA宣布可以检测人或兽用注射药品成品的内毒素并进入药典，但没有在药典正文中收载品种Ø

1983年药典中规定5种大输液40种放药开始使用内毒素法同时5种大输液删除了相应的家兔热原试验部分Ø

1983年后品种逐

增加NationalInstitutesforFoodandDrugControl在英国、欧洲、日本的发展欧洲药典英国药典1987年收载1989年增补版收载方法没有品种1990年注射用水1992年发布指导原则用于检查注射用水1990年后品种逐渐增加1992年后品种逐渐增加日本药局方1991年正式收入药局方品种只有注射用水NationalInstitutesforFoodandDrugControl1991年后品种逐渐增加细菌内毒素检查法在我国的发展历史Ø

1975年开始研究Ø

1979年第一批内毒素标准品Ø

1988年卫生部颁布《检查法》Ø

1993年《中国药典》1990年版第二增补本收载《检查法》Ø

1995年《中国药典》1995年版收录注射用水等5种注射用药品Ø

2000年《中国药典》中品种逐渐增加至69种Ø

2005年《中国药典

中有205种Ø

2010年《中国药典》中有506种NationalInstitutesforFoodandDrugControlØ

2015年《中国药典》中有65内毒素检查法世界范围内统一（国际化）•

标准物质统一•

细菌内毒素检查法的统一NationalInstitutesforFoodandDrugControl国际标准物质的统一以效价作为单位1980年完成重量到效价的转变ng

EU1982年美国药典开始采用效价单位EUEndotoxinUnit（EU）内毒素单位NationalInstitutesforFoodandDrugControl国际标准物质的统一•

美国

EndotoxinUnit（EU）内毒素单位•

WHO

InternationalUnit（IU）国际单位•

WHO建立内毒素国际标准品1985年第一批国际标准品

0.7IU=1.0EU1995年第二批国际

准品

1.0IU=1.0EU2013年第三批国际标准品

1.0IU=1.0EUNationalInstitutesforFoodandDrugControl内毒素检查法的统一（国际化）•

方法的统一：从2001年1月起美国药典(USP)欧洲药典(EP)日本药局方(JP)开始执行统一的细菌内毒素检查法（BET）法。即“《细菌

毒素检查法》国际协调方案（ICH

Q4B14）”。•

《中国药典》自200年版起同世界接轨•

《中国药典》200年版和2015年版内毒素检查法也与协调案保持一致NationalInstitutesforFoodandDrugControl细菌内毒素检查方法的分类•

细菌内毒素检查方法包括：浊度法

动态浊度法限度实验光度测定法终点浊度法凝胶（定量实验)半定量实验显色基质法动态显色法终点显色法•

可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。NationalInstitutesforFoodandDrugControl细菌内毒素检查凝胶法凝胶法p

凝胶法系利用细菌内毒素与鲎试剂反应可形成凝胶的原理，来测定供试品中的内毒素含量是否符合规定。NationalInstitutesforFoodandDrugControl反应原理内毒素（旁路反应）二价离子pH6.0~8.0β-葡聚糖鲎试剂凝胶法•

主要操作：将供试品溶液0.1ml

+鲎试剂0.1ml在管中混匀，37℃+1

℃

下反应60+2min。•

如果供试品溶液中所含的内毒素≥鲎试剂的灵敏度就会形成坚实凝胶。•

灵敏度：所

鲎试剂能够检测的最低内毒素浓度。NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•

缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者•

坚实凝胶•

阳性“+”NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•

未形成凝胶•凝胶不坚实、变形、从管壁滑脱者•

阴性“—”NationalInstitutesforFoodandDrugControl假阴性、假阳性供试品溶液假阴性（抑制干扰）鲎试剂干扰作用毒内素假阳性（增强干扰）NationalInstitutesforFoodandDrugControl干扰作用•

大部分的干扰作用都可以通过使用细菌内毒素检查用水稀释供试品的方法排除。•

当有些干扰作用仅使用稀释法不能排除时，可采用其他方法消除干扰因素，然后再进行试验。NationalInstitutesforFoodandDrugControl干扰作用常见干扰因素及排除方法干扰因素干扰作用类型

排除方法供试品溶液本身为强酸、强

抑制

将供试品的pH值调节碱，

本身具有偏酸偏碱的缓冲作用至6.0~8.0含有螯合剂（如EDTA）抑制

添加适当Ca2+、Mg2+含有某些抗凝因子抑制

将供试品适当加热，使抗凝因子失活含葡聚糖类物质增强

使用抗增液或特异性鲎试剂NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法——有3个部分新鲎试剂在使用前•

鲎试剂灵敏度复核•

干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验要对其灵敏度进行复核•

检

查

法：限度试验半定量试验NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•

鲎试剂灵敏度复核新品种在建立细菌内毒素检查法时需使用干扰试验进行方法学研究，以验证样品是否对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰作用，确定在何条件下不再存在干扰作用，可得到准确可靠的检验结果。•

干扰实验：预实验（SOP）正式•

检

查

法：限度试验半定量试验trol凝胶法•

鲎试剂灵敏度复核•

干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验•

检

查

法：限度试验半定量试验日常检验NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•

鲎试剂灵敏度复核•

干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验•

检

查

法：限度试验半定量试验NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•

鲎试剂灵敏度复核•

干扰实验：预实验（SOP）正式干扰实验•

检

查

法：限度试验半定量试验NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•

鲎试剂灵敏度复核NationalInstitutesforFoodandDrugControl鲎试剂灵敏度复核试验实验操作:•

取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，加入规定量的细菌内毒素检查用水溶解其内容物•

用

口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合1

分钟。•

然后进行稀

，制备成4个浓度的细菌内毒素标准溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度），每

混合30秒NationalInstitutesforFoodandDrugControl鲎试剂灵敏度复核试验内毒素浓度

2λ

λ

0.5λ

0.25λ

阴性对照鲎试剂平行管u加样时，每管标准溶液需再混合10秒

加样后，将混合液轻轻混匀37℃±1℃保温60分钟±2分钟NationalInstitutesforFoodandDrugControl鲎试剂灵敏度复核试验反应终点浓度内毒素浓度

2λ

λ

0.5λ

0.25λ

阴性对照+————试剂+平行管+——+试验有效NationalInstitutesforFoodandDrugControl鲎试剂灵敏度复核试验反应终点浓度内毒素浓度

2λ

λ

0.5λ

0.25λ

阴性对照+

+————试剂——λ++++平行管λ+

++

+——0.5λ0.5λλc=lg-1（(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4)=0.707λugControl鲎试剂灵敏度复核试验•

当λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查。•

以标示

敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。NationalInstitutesforFoodandDrugControl鲎试剂灵敏度复核试验灵敏度复核试验的用途：•

不仅可考察鲎试剂灵敏度是否准确•

可用于实验人员、条件、环境等的验证NationalInstitutesforFoodandDrugControl鲎试剂灵敏度复核试验ü

可使用鲎试剂国家参考品或日常使用的鲎试剂（灵敏度准确），内毒素标准品ü

比较结果Ø

人员

考核Ø

环境

定期验证Ø

或当有任何可能会影响实验结果的改变发生时（如：仪器的维修、洗液、

材的更换Nati）onalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法•

检查法——凝胶限度试验NationalInstitutesforFoodandDrugControl检查法——日常检验•

1.

限值的确定及最大有效稀释倍数（MVD）的计算2.

供试品溶液的制备•

3.

检查法——限度实验NationalInstitutesforFoodandDrugControl1、限值的确定•

《中国药典》标准、国家药品标准•

企业标准等•

应小于*EU/ml、EU/mg、EU/UNationalInstitutesforFoodandDrugControl1、计算最大有效稀释倍数（MVD）•

最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限度的检测。MVD=cL/λ•

L：内毒素限值；•

c：供试品

液的浓度，•

λ：为凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）NationalInstitutesforFoodandDrugControl2、供试品溶液的制备•

溶于水的供试品：

检查用水复溶、稀释•

不溶于水的供试品：其他溶剂溶解（酒精、DMSO等），再用检查用水稀释。要对溶剂进行：不干扰的稀释倍数验证、内毒素含量检验。•

医疗器械：

液中浸提制成供试品溶液。NationalI3、检查法——凝胶限度试验•

凝胶限度试验——检验供试品中的内毒素含量是否小于限值的定性方法。•

每批供试品必须做2支供试

管2支供试品阳性对照同时

每次实验须做2支阳性对照和2支阴性对照。NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照Ø

供试品管：稀释倍数小于或等于MVD的供试品溶液检验供试品内毒素限量NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照Ø

供试品管：稀释倍数小于或等于MVD的供试品溶液Ø

供试品阳性对照：含2λ标准内毒素的供试品溶液（稀释倍数与供试品管的相同）验证样品是否存在抑制干作用，避免供试品的阴性结果为假阴性结果NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照Ø

供试品管：稀释倍数小于或等于MVD的供试品溶液Ø

供试品阳性对照：含2λ标准内毒素的供试品溶液（稀释倍数与供试品管的相同）Ø

阴性对照：细菌内毒素检查用水系统无内毒素污染NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照Ø

供试品管：稀释倍数小于或等于MVD的供试品溶液Ø

供试品阳性对照：试品溶液系统整体条件符合内毒（稀同）素实验要求Ø

阴性对照：细菌Ø

阳性对照：浓

为2λ的标准内毒素溶液NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照Ø

供试品管：检验供试品内毒素限量Ø

供试用，NationalInstitutesforFoodandDrugControl对照成立是试验成立的必

条件凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照+

+-

-+

+n

试验有效NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照-

-+

+-

-+

+n

供试

的内毒素含量小于限值，符合规定。NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照+

++

+-

-+

+n

供试品的稀释倍数=MVD时，内毒素含量不小于限值，不符合规

。n

供试品的稀释倍数＜MVD时，将供试品稀释至MVD试验NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照+

-+

+-

-+

+n

复试NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验•

复试时，供试品溶液需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定供试品溶

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照++-

-+

+NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验•

结果出现

异常

时的分析NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照+

+阴

对照为“+”

，原因分析：Ø

系统中存在内毒素污染•检查用•移液管、试管、吸头（内毒素灭活）•环境Ø

样品阳性结果不成立NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照-

-阳

对照为“-”

，原因分析：Ø

内毒素标准品稀释是否准确，混合充分？Ø

鲎试剂

敏度、有效期Ø

反应温度、时间Ø

所用试剂、器

是否有抑制干扰•检查用水

吸头

试管、移液管（洗液残留）NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照-

-+

+供

品阳性对照为“-”

，原因分析：Ø

内毒素标准品稀释是否准确，混合充分？Ø

供试品

在抑制干扰作用•进一步稀释排除干扰，或寻找干扰原因排除•进行实验，直至

“+”NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶限度试验供试品管

供试品阳性对照

阴性对照

阳性对照+

+-

-+

++n

供试品为“+”时，启动“可疑结果处理程序”NationalInstitutesforFoodandDrugControl可疑结果处理程序处理程序•

实验人员首先对实验项目进行回顾：Ø

1.检验用标准Ø

2.检验操作Ø

记录和计算Ø

4.仪器状态Ø

5.标准物Ø

6.试剂质量Ø

7.其他异常现象

是否有可能存在污染，环境、器械…）•

复核人员进行复核NationalInstitutesforFoodandDrugControl可疑结果处理程序处理程序•

若发现检验人员检验过程存在异常，复核人员以正确的检验过程重复实验一次，以取代最初的实验结果。若未发现检验人员检验过程存在异常，为了确定不合格结果是否由测试或分析误差原因造成，复核人员可重复实验。NationalInstitutesforFoodandDrugControl可疑结果处理程序处理程序•

排除假阳性干扰（葡聚糖类物质）!抗增液、特异性鲎试剂•

定量试验提供数据参考•

不同鲎试剂的使用NationalInstitutesforFoodandDrugControl细菌内毒素检验要点ü

标准无误ü

计算正确ü

稀释准确ü

混合充分ü

试剂有效ü

仪器正常ü

灭活完全ü

环境清洁ü

排除干扰

样品、水、耗材等）NationalInstitutesforFoodandDrugControl细菌内毒素检查光度测定法NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法简介q

光度测定法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中发生的浊度或色度的变化而测定内毒素含量的方法。NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法简介4种方法•

终点浊度法动态浊度法•

终点显色法动态显色法NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法简介4种方法•

终点浊度法动态浊度法•

终点显色法动态显色法仪器：内毒素测定仪仪器：分光光度仪酶标仪酶标仪（可进行动态检测）NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法简介4种方法•

终点浊度法•

终点显色法比较常用NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法简介p

光度法本质：使用内毒素标准物质制备标准曲线，反求出样品中的内毒素含量值。终点法回归曲线动态法回归曲线ClgTAlgC回归方程：C=aAb相关系数r>0回归方程：lgT=algC+b相关系数r<0NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法q

光度测定法实验部分v

准曲线的可靠性实验v

干扰实验v

检查法NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法q

光度测定法实验部分v

准曲线的可靠性实验v

干扰实验v

检查法——以动态浊度法实验为例讲解NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法u动态浊度法u流感病毒疫苗规格：1ml/支限值：20EU/mlNationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法内毒素定量测定仪动态浊度法鲎试剂反应容器——配套小试管NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法名称内容支数标准曲线0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU/ml

每一浓度做2个平行管供试品溶液80倍稀释液2个平行管供试品含0.125EU/ml标准内毒素的80倍供试品稀释液2个平行管回收溶液阴性对照.1ml细菌内毒素检查用水做2个平行管NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法名称内容支数标准曲线0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU/ml

每一浓度做2个平行管2个平行管供试品溶液•至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。供试品2个平行管回收溶液阴性对照做2个平行管NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法名称内容支数标准曲线0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU/ml

每一浓度做2个平行管供试品溶液80倍稀释液2个平行管供试品含.1EU/ml标准内毒素的2个平行管回收溶液小于MVD下的无干扰的供试品稀释液MVD=cL/λ=20÷0.03=666倍阴性对照做2个平行管λ：所使用的标准曲线上最低的内毒素浓NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法添加了已知标准内毒素的供试品稀释液，名称支数用于计算回收率R标准曲线每一浓度做2个平行管2个平行管供试品溶液80倍稀释液供试品含0.125EU/ml标准内毒素的80倍供试品稀释液2个平行管回收溶液阴性对照.1ml细菌内毒素检查用水做2个平行管NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——干扰试验•

回收率R的计算：üüü供试品回收溶液的内毒素含量（Cs）供试品溶液的内毒素含量（Ct）已知添加的标准内毒素的量（λm，为标准曲线的中点或中点附近点的浓度）R=（Cs-Ct）/λm×100%•

抑制>50%~200%<增强NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法名称内容支数标准曲线0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU/ml

每一浓度做2个平行管供试品溶液80倍稀释液2个平行管供试品含0.125EU/ml标准内毒素的80倍供试品稀释液2个平行管回收溶液阴性对照.1ml细菌内毒素检查用水做2个平行管NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法名称内容支数标准曲线0.5、0.25、0.125、0.06、0.03EU/ml

每一浓度做2个平行管供试品溶液80倍稀释液2个平行管供试品含0.125EU/ml标准内毒素的80倍供试品稀释液2个平行管回收溶液阴性对照.1ml细菌内毒素检查用水做2个平行管NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法u

设定定量测定仪的反应程序ontrol光度测定法——检查法u

将内毒素、供试品、供试品回收溶液及阴性对照加入反应试管u

每管加入0.1mlNationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法溶解动态浊度

试剂并将鲎试剂混合NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法u

每管中加入0.1ml体积的鲎试剂，轻轻混匀，避免产生气泡u

然后将反应试管放入光度测定仪中进行反应NationalInstitutesforFoodandDrugControl在反应过程中可随时观察反应曲线通过每一条反应曲线可确定每

试管中的反应是否已达到预设的浊度值可提前结束实验u

反应结束后，

器拟合出标准曲线u

并计算出回收率及内毒素含量光度测定法——检查法名称结果要求标准曲线线性相关系数|r|≥0.980供试品溶液实验有效供试品回收溶液回收率在50%～200%之间阴性对照反应时间＞标准曲线最低浓度点的反应时间NationalInstitutesforFoodandDrugControl光度测定法——检查法名称结果要求标准曲线线性相关系数|r|≥0.980供试品溶液平行管的内毒素平均值小于限值，合格平行管的内毒素平均值不小于限值，不合格供试品回收率在50%～200%之间时回收溶液阴性对照反应时间＞标准曲线最低浓度点的反应时间NationalInstitutesforFoodandDrugControl凝胶法与光度法比较凝胶法光度法检测结果

限量、半定量

定量，可检测出具体数值更为精确反应时间

1小时

可根据实验进程终止实验（一般小于1小时）实验

日常检验方便

日常检验较方便设计及操作

干扰实验较复杂

干扰实验可通过回收率观察干扰趋势成本较低

常规样品凝胶法有优势，非常规样品及研究性质的样品光度法更有优势NationalInstitutesforFoodandDrugControlu

并计算出回收率及内毒素含量凝胶法与光度法比较凝胶法光度法检测结果

限量、半定量

定量，可检测出具体数值更为精确反应时间

1小时

可根据实验进程终止实验（一般小于1小时）实验

日常检验方便

日常检验较方便设计及操作

干扰实验较复杂

干扰实验可通过回收率观察干扰趋势成本较低

常规样品凝胶法有优势，非常规样品及研究性质的样品光度法更有优势NationalInstitutesforFoodandDrugControl干热法除热原及验证标准品介绍odandDrugControlGMP下干热去除热原的方法烘箱隧道uu干热处理是玻璃器材和其它耐热材料最常见的去热原工艺。通常去除热原的方法：250℃至少加热30min，要求内毒素指3个lNationalInstitutesforFoodandDrugControl示剂的内毒素含量下降新观点•

USP

发布了新的通论1228.1《DryHeatDepyrogenation干热去热原》：认为关注待处理物料（如玻璃瓶）的内毒素本底含量，和处理后物料的内毒素残留水平（当内毒素下降到≤0.1EU时，该工

被认为可以接受。），比单纯的关注内毒素下降度更有意义。•

EP5.1.12注射剂生产中所用材料除热原

征求意见稿：常见的干热除热原循环包括将材料放在温度250℃条件下至少30分钟，亦可使用与其它温度（高于170℃

）和时长组合。NationalInstitutesforFoodandDrugControl新观点•

USP

发布了新的通论1228.1《DryHeatDepyrogenation干热去热原》：认为关注待处理物料（如玻璃瓶）的内毒素本底含量，和处理后物料的内毒素残留水平（当内毒素下降到≤0.1EU时，该工

被认为可以接受。），比单纯的关注内毒素下降度更有意义。•

EP5.1.12注射剂生产中所用材料除热原

征求意见稿：常见的干热除热原循环包括将材料放在温度250℃条件下至少30分钟，亦可使用与其它温度（高于170℃

）和时长组合。验

证tesforFoodandDrugControl内毒素的耐热性可使10000EU下降3log的干热时间250℃5min5min220℃30min90min200℃60min180℃120min内毒素指示剂环境内毒素大于120min大于180min内毒素指示剂是纯化后的内毒素，耐热性低于环境内毒素NationalInstitutesforFoodandDrugControl细菌内毒素国家标准品（干热法灭活验证用）Ø名称：细菌内毒素国家标准品（干热法灭活验证用）Ø来源：使用酚水法从菌号为O111B4的大肠杆菌中提取制备得到Ø制备工艺：加入赋形剂冷冻干燥制得。Ø用途

用于验证干热灭菌柜、烘箱、隧道等设备去除细菌内毒素的有效性。Ø效价溯源：使用第3批细菌内毒素国际标准品（NIBSCCode：10/178）经14家实验室协作标定确定其效价。Ø规格：10000EU/支Ø批号：150604-201802NationalInstitutesforFooda细菌内毒素国家标准品（干热法灭活验证用）使用方法•

1.

将内毒素指示剂置于干热设备内•

2.

过一个干热程序后，取出指示剂•

3.

测定指示剂中残余的内毒素含量（应小于10EU/支）•

4.

log（10000EU）-log（残余内毒素含量EU）>3NationalInstitutesforFoodandDrugControl去热原工艺验证•

参考USP1228.1《DryHeatDepyrogenation干热去热原》•

烘箱空载温度分布•

烘箱负载温度分布•

去热原的确认•

隧道空载温度分布•

隧道负载温度分布•

去热原的确认NationalInstitutesforFoodandDrugControl烘箱去热原工艺验证•

烘箱应评估空载温度分布•

采用空气的对流方式干热去除热原，加热介质的均匀性是一个重要参数。•

气流的大小直接影响腔室内的温度分布状况。andDrugControl烘箱去热原工艺验证•

烘箱应评估空载温度分布•

气流模式确立后，便可测得灭菌腔室的温度分布模式。比如确定温差、热点、冷点，升温速度慢的区域等。•

通过测量烘箱每个角落，控制探头附近和其他合理的位置的温度进行评估。NationalInstitutesforFoodandDrugControl烘箱去热原工艺验证•

烘箱负载温度分布•

验证最大和最小装载(通过物品数量或其质量决定)•

负载温度分布是要确保放置在整个负载中的物品达到所需的去热原条件。•

在去热原

序的设计过程中,应确定烘箱内的冷区NationalInstitutesforFoodandDrugControl烘箱去热原工艺验证•

去热原的确认•

在烘箱中的不少于10个温度测试点(包括从烘箱负载温度分布研究中确定的最冷点)•

每个点附近至少应采集5个样品•

检测其处理后的

毒素含量在验证期间，要在被识别为最难加热的位置（因此也是热原最难除去的位置）放入适当的内毒素指

，以验证Na除tion热alIns原titut的esfo效rFo果odandDrugControl。隧道去热原工艺验证•

隧道空载温度分布•

去热原隧道的空载温度分布变化总是远远大于隧道满载时。•

因此,对于去热原隧道,只规定了在满载条件下的温度研究。ontrol隧道去热原工艺验证•

隧道负载温度分布•

负载温度分布的评估可以使用在玻璃瓶中放置一组经过校准的传感器(即有线或无线温度传感器)并通过

道来进行。•

温度传感器应与容器底部的玻璃物品直接接触。•

温度测量应在玻璃瓶堆的前缘、中间(最高密度)和后缘上覆盖整

隧道宽度。•

在负载的每个部分,网带上应放置不少于5温度传NationalInstitutesforFoodandDrugControl感器。隧道去热原工艺验证•

去热原的确认•

应在隧道负载内每个测试点附近至少采集5个样本(包括隧道负载温度分布研究中确定的最冷点)，•

并检验其处理后的内毒素含量。NationalInstitutesforFoodandDrugControl细菌内毒素实验涉及内容及相关要求NationalInstitutesforFoodandDrugControl涉及内容•

人员•

试剂、耗材•

仪器•

试验环境NationalInstitutesforFoodandDrugControl人员及实验室资质Ø

要求参加过有关于细菌内毒素检验的相关培训并有记录或证书Ø

参与外部能力验证（PTS）第

年4次第二年2次一年一次NationalInstitutesforFoodandDrugControlDrugControl•

中检院细菌内毒素实验测量审核（凝胶法、动态浊度法）•

质量管理处ationalInstitutesforFoodandDrugControl试剂、耗材•

标准品•

鲎试剂•

检查用水•

试管•

吸头•

酶标板等NationalInstitutesforFoodandDrugControl试剂、耗材•

细菌内毒素国家标准品用于：标定工作标准品鲎试剂灵敏度的标定和仲裁及相关实验可多次使用（冷藏保存一周，冷冻保存四周）•

细菌内毒素工作标准品以内毒素国家标准品为基准标定效价用于：相关实验一次性使用•

应使用中检院生产的标准品NationalInstitutesforFoodandDrugControl试剂、耗材鲎试剂•

厂家质检报告•

凝胶法——灵敏度复核•

光度法——标准曲线可靠性验证NationalInstitutesforFoodandDrugControl试剂、耗材检查用水•

细菌内毒素含量（限量）检测无干扰•

不可

其他水替代NationalInstitutesforFoodandDrugControl试剂、耗材试管•

材质：对内毒素无吸附•

洗刷验证：对细菌内毒素检验无干扰作用NationalInstitutesforFoodandDrugControl试剂、耗材吸头、酶标板•

厂家质检报告，•

对内毒素的要求；无干扰•

吸头开启后有效期的验证NationalInstitutesforFoodandDrugControl仪器设备•

恒温水浴•

细菌内毒素定量测定仪•

恒温干燥箱•

冰箱、冰柜•

微量移液器等NationalInsitutesforFoodandDrugControl仪器设备•

恒温水浴•

细菌内毒素定量测定仪•

恒温干燥箱ü

3Q验证记录ü

计量校准ü

性能验证ü

期间核查ü

操作SOPü

使用记录•

冰箱、冰柜•

微量移液器NationalInstitutesforFoodandDrugControl仪器设备恒温水浴•

温度校准：37℃•

使用区域：水面下3cm左右，整个水面•

使用时间：1小时NationalInstitute