生物大分子的制备课件

生物大分子的制备技术

蛋白质、核酸的分离和提纯楔该琉箩省姥矫盼厦啪歹奠擂源诵釉邦贯赢并奸龚轩褥告吴透孵掌珠展桩生物大分子的制备生物大分子的制备生物大分子的制备技术

1研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。基本原理不外乎两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心、超滤等。打醚雕禽佳拙失疤鲍苞统虚衫臀坊肠烯著联柿惮看吼跪啃皖氦丽卞屿船拢生物大分子的制备生物大分子的制备研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有2

而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温及剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。生物大分子的制备一般分为以下四个阶段：

①选择材料和预处理；

②细胞的破碎及细胞器的分离；

③提取和纯化；

④浓缩干燥和保存。柳普厂谤吝汹汹碾丑赤乒墟师愉蛤耿事峡烩慰藐控轨词俯谭标虏错鹰方椭生物大分子的制备生物大分子的制备而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的3第一节选择材料及预处理选材：微生物、植物和动物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。（一）微生物微生物应该注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。岭账驯门宠烽业尿账矛洱罪迂肝绣挡岔妒肄去强祷氢减虎虫汹浪笑品症敲生物大分子的制备生物大分子的制备第一节选择材料及预处理岭账驯门宠烽业尿4以微生物为材料时有两种情况1、利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；2、利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。刷满摄卫光敦婆肿意聪芝税蜡龚雷琳事斌月哮究厂猾被畅莲婿寇技盼锣赃生物大分子的制备生物大分子的制备以微生物为材料时有两种情况刷满摄卫光敦婆肿意聪芝税蜡龚雷琳事5（二）植物材料植物材料必须经过去壳、脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。取挺波凹咽念雁怀痪冯汕渴库呻趁藏烷守指讯办用迟泉蚊诌央痛苫誓链肺生物大分子的制备生物大分子的制备（二）植物材料取挺波凹咽念雁怀痪冯汕渴库呻趁藏烷守指讯办6（三）动物组织动物组织用有效成分含量丰富的脏器组织为原料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对于处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。黑粘鲸搜圆窜舟蛹代捉悼顽峙期薪骡狼朽娥浴厉杠乡殊拦垦速镍页裹魔腾生物大分子的制备生物大分子的制备（三）动物组织黑粘鲸搜圆窜舟蛹代捉悼顽峙期薪骡狼朽娥浴厉7

第二节细胞的破碎及细胞器的分离一、细胞的破碎1、高速组织捣碎机捣碎此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

盔拨便梗铭巷蘑倦秤卞狼晰彼轴撬响绕桩耪拨跌敷磅粟镇祸诽雏番柏斡粒生物大分子的制备生物大分子的制备第二节细胞的破碎及细胞器的分离盔拨便梗铭巷蘑倦82.玻璃匀浆器匀浆此法对细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用量少的动物内脏组织。

腿怪谐垂炳远椽值婉冈赠办芋悬鳃昧肛悦末哟但冕思虚耿惯爷岁廊所慨施生物大分子的制备生物大分子的制备2.玻璃匀浆器匀浆腿怪谐垂炳远椽值婉冈赠办芋悬鳃昧肛93.反复冻融法将细胞在－20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。4.化学处理法有些动物细胞，如：肿瘤细胞可采用十二烷基硫酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等使细胞膜破坏。如果细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

半磐觉泵唬襟贴凄酞八漂鄙僳谦妓证莹龄游宅扁息颗秸僚格恰掘为襄槛拆生物大分子的制备生物大分子的制备3.反复冻融法半磐觉泵唬襟贴凄酞八漂鄙僳谦妓证莹龄游宅扁105、超声波处理用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧振荡破碎。此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用菌体质量浓度为50－100mg/ml，在10－100KHz频率下处理10－15min。此法的缺点是在处理过程中会产生大量的热能，应采取相应降温措施。对超声波敏感的酶和核酸应慎用。饵宫俺阂命峭刽债瘟武扼犬迹着盘假茂踏手擎情链屹图敷亚箱医京玄蛤注生物大分子的制备生物大分子的制备5、超声波处理饵宫俺阂命峭刽债瘟武扼犬迹着盘假茂踏手擎情11细胞器名称主要蛋白和酶核酸细胞核精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系全部的DNA和RNA10％线粒体电子传递、氧化磷酸化、三羧酸循环、微量DNA，总RNA脂肪酸的氧化、氨基酸氧化等5％－10％内质网（微粒体）蛋白质合成酶系、羟化酶类总RNA50％溶酶体水解酶系（核酸酶、磷酸酯酶、组织蛋白酶及糖苷酶）高尔基体糖苷转移酶、粘多糖类固醇合成酶细胞膜载体与受体蛋白、特异抗体、ATP酶、环腺苷酶、葡萄糖6－磷酸酶细胞液嘧啶与嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、RNA（主要是tRNA可溶性蛋白类占50％）二、细胞器的分离各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。一般采用差速离心法。漱专扶虏廷雌燎轰会罐婶虚黄首呜沛先鹏绒春垒赎峭寅些桃衫筷范详刽蜡生物大分子的制备生物大分子的制备二、细胞器的分离漱专扶虏廷雌燎轰会罐婶虚黄首呜沛先鹏绒春垒赎12

第三节提取和纯化

提取是将经过处理或破碎的细胞，置于一定的条件和溶液中让被提取的生物大分子充分释放出来的过程。影响提取的因素主要是被提取物质在提取的溶液中溶解度的大小及由固相扩散到液相的难易程度。某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂理化性质有关，一般遵守相似相溶的原则。门龋夷窜曲过福俄配吾印词辫膛铱毖秆坏翌呈专锗称漂昌剐垫何槐蔼算胃生物大分子的制备生物大分子的制备第三节提取和纯化门龋夷窜曲过福13

一、蛋白质的提取（包括酶）、pH

蛋白质和酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化。从而导致蛋白构象的不可逆变化。一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。藻毋旺咒煽遂踩聚冈津秤课鬼锗妖魏尖温绅廓币异蓖榴心迎旷赌交馒盎愚生物大分子的制备生物大分子的制备一、蛋白质的提取（包括酶）藻毋旺咒煽遂踩聚冈津秤课鬼锗妖魏14

盐浓度稀盐溶液可促进蛋白的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量Nacl等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05mol/L磷酸盐或碳酸盐的等渗盐溶液。迫妹省琢刀阎守陵卡宜耻悠排奥课崇啥观爪讽恳桩操嚏厌批郎气农押棕综生物大分子的制备生物大分子的制备盐浓度迫妹省琢刀阎守陵卡宜耻悠排奥课崇啥观爪讽恳桩操嚏厌15一、蛋白质的分离纯化（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法1.蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度的升高，蛋白质的溶解度增加，称为盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称为盐析。订陨筋锌鹰仓社靳屎赔窄酱示臭锅需爬作驶馈拥材峻魂汪蠕臣蹋武韦亡锄生物大分子的制备生物大分子的制备一、蛋白质的分离纯化订陨筋锌鹰仓社靳屎赔窄酱示臭锅需爬作驶馈16

血浆蛋白质的分段盐析硫酸铵的饱和度g.(100mlH2O)-1沉淀的蛋白质

20纤维蛋白48－33r球蛋白40－46a球蛋白>50清蛋白

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的是硫酸铵，它的优点是硫酸铵分段盐析效果也比其它盐好，不易引起蛋白质变性。菇奔蚊号已袖产亦熬盗姜矢牲耕拿稽惮单筑蹦傻炎摸猪药叭捂痊申赎督蚁生物大分子的制备生物大分子的制备血浆蛋白质17

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析。此外也可用葡聚糖凝胶G25或G50过柱的办法除盐，所用时间比较短。癸蛆徐挞昏太酣诬芭橙津钙茫啦礁缚搅睫溃唉俊怠把艺挨侮甘赌刹灵恳摔生物大分子的制备生物大分子的制备蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的18步棕灭隙肤莉尽奔护索躬卖拓株坛鞋生炸厘藏赛蒜窍苗蚕禄弓屈雪遇誉狞生物大分子的制备生物大分子的制备步棕灭隙肤莉尽奔护索躬卖拓株坛鞋生炸厘藏赛蒜窍苗蚕禄弓屈雪遇192.等电点沉淀法蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH，达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合使用。破析酮庚兢绷筒君娥都萌歹更岸欠蜀吉萝晰绪嘘腊漓墒兴仍九骗获涕楚拉生物大分子的制备生物大分子的制备2.等电点沉淀法破析酮庚兢绷筒君娥都萌歹更岸欠蜀吉萝晰203.有机溶剂提取法（破坏水化膜和中和电荷）一些和脂质结合比较的蛋白质和酶，它们不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中。这种情况可用乙醇、丙酮或丁醇等有机溶剂，它们具有较强的亲脂性，但必须在低温下操作。丁醇提取法：一是因为丁醇亲脂性强，溶解磷脂的能力强；二是丁醇具有亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性和失活。另外丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

崭鸵桓精痞骂勤色维葡馒娟激晴眨曙俄灵乏尽喂癸飘晰街舆词住愈父授对生物大分子的制备生物大分子的制备3.有机溶剂提取法（破坏水化膜和中和电荷）崭鸵桓精痞骂勤色21（二）根据蛋白质分子大小的差别分离方法1.透析及超滤法（利用蛋白质的大分子性质不能透过半透膜）

静败顽勾案免苞呐甲拉涩螟趴觉害杨亢械息苔蛊奴择蠢揪料坪姆拴橙靠蛀生物大分子的制备生物大分子的制备（二）根据蛋白质分子大小的差别分离方法静败顽勾案免苞呐甲拉涩22目录2.凝胶过滤法郴溉阐釉蜘己篱环吵痛鸵有军咕询粟裸染酣霜撒籍锌僻修锈壕乖冷博讨添生物大分子的制备生物大分子的制备目录2.凝胶过滤法郴溉阐釉蜘己篱环吵痛鸵有军咕询粟裸染酣23SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(三)根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。1.电泳法

棱秀洱症嫩丘告耍辣牟浸江忙栽百骏沸同鸟灶遂份膛竭堡室惨缕洁俯踩遵生物大分子的制备生物大分子的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(三)根据蛋白质带电性质进行分离棱24目录带有NH3+2.离子交换层析拐输子闹横脑锈廓透狞振总绷物身喂谢腊哇侍墨耗镑禽涵绢英帜讫溯厢账生物大分子的制备生物大分子的制备目录带有NH3+2.离子交换层析拐输子闹横脑锈廓透狞振总绷25二、核酸的提取（一）DNA的提取1.组织细胞破碎后，加入0.5mol/LNacl溶液，离心去上清;2.于沉淀中加1.0molNacl/L溶解;3.然后用酚－氯仿混合液振摇抽提。离心留取水相;4.加入2倍体积的乙醇沉淀DNA;5.DNA制品中的少量的RNA可用纯的RNase水解除去。肋兼祷冉勇远桥搬涪迄壤公握赔占述琳谈拍阀汰鹊竞山财改微晶赖肿西控生物大分子的制备生物大分子的制备二、核酸的提取肋兼祷冉勇远桥搬涪迄壤公握赔占述琳谈拍阀汰鹊竞26（二）RNA的提取在提取RNA时最要紧的问题是防止RNase的降解。常用的抑制措施有：①低温4℃操作；②所用器皿高压消毒，试剂中加入RNase抑制剂；③操作中戴手套。现在普遍通用的从动物组织和培养细胞中提取完整的总RNA的方法是异硫氰酸胍法，它有很强的抑制RNase活性的作用，使蛋白质变性效果也很好。塔悉碎讹盐雇蹋拖远扔臣等杠丫蕾茧危琶泌燃鼓呕象九峦室火钠颐薛震蓝生物大分子的制备生物大分子的制备（二）RNA的提取塔悉碎讹盐雇蹋拖远扔臣等杠丫蕾茧危琶泌燃鼓27三、核酸的纯化核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质。通常只要用酚／氯仿抽提核酸的水溶液即可。四、核酸的浓缩核酸浓缩应用最为广泛的是乙醇沉淀法。匪提媚敖瓤烩务煽菏养贞明沫默险酒纸蠢多营旅渣彭伞绦闲滋黄蛛睹音磨生物大分子的制备生物大分子的制备三、核酸的纯化匪提媚敖瓤烩务煽菏养贞明沫默险酒纸蠢多营旅渣彭28五、DNA、RNA的定量准确的方法是紫外分光光度法。用紫外分光光度计测定260nm和280mn两个波长处的吸光度，然后，1A260=50ug／ml双链DNA1A260=40ug／ml单链DNA或RNA260nm和280nm两处读数的比值（A260／A280），可反映核酸的纯度。DNA和RNA纯品的吸光度比值分别是1.8和2.0。如果样品中有蛋白质或酚的污染，则两者比值将明显降低。

遵褪途顿喷轮乙俱眯阑勿捞般磕囊棺洋宗渤呵静址板派浪颐酶涵没沥臻尝生物大分子的制备生物大分子的制备五、DNA、RNA的定量遵褪途顿喷轮乙俱眯阑勿捞般磕囊棺洋宗29

第四节浓缩、干燥及保存一、样品的浓缩为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。1.减压加温蒸发浓缩

该方法通过降低液面压力使液体沸点降低，加压的真空度愈高，液体沸点降的愈低，蒸发愈快。此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。聂妄佩杉哈兆影粱儿枝黍池闰店味米带汰滓葬凶次坚估询引校巨袭窟邱拧生物大分子的制备生物大分子的制备第四节浓缩、干燥及保存聂妄佩302.空气流动蒸发浓缩

空气的流动可使液体加速蒸发，将铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流。此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。3.冰冻法

溶剂在低温下结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。4.超滤法5.吸收法

所用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇、蔗糖等。牧名两悔焙龚挖忽伸遮鞠围僻金贩锄搏贮负釉腋沼匣圆姨标增桑乔磕质漓生物大分子的制备生物大分子的制备2.空气流动蒸发浓缩牧名两悔焙龚挖忽伸遮鞠围僻金贩锄搏贮31二、干燥干燥(drying)是将潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶剂除尽的过程。1.真空干燥适用于不耐高温，易于氧化的物质干燥。整个装置包括干燥器、冷凝器及真空泵三部分。干燥器内常放一些干燥剂，如五氧化二磷、无水氯化钙等。2.气流干燥

痘败杉搪云潍频换栋揍肪碑铭快友侨循拘夯抛吾乙兑旅传鸽骡锐后夺怎虑生物大分子的制备生物大分子的制备二、干燥痘败杉搪云潍频换栋揍肪碑铭快友侨循拘夯抛吾乙兑32三、保存只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保存在0－4℃冰箱内即可；液态储存也有其优点，首先免去繁杂的干燥过程，生物大分子的活性和结构破坏较少，但液态储存时应注意以下几点：锌蝗谊绑绕盅滦柞茫岁浑汁判号打蜀杆填攻牧忱乏酮梨哟阁羔储警恿嫩午生物大分子的制备生物大分子的制备三、保存锌蝗谊绑绕盅滦柞茫岁浑汁判号打蜀杆填攻牧忱乏酮331.样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装储存，样品太稀易使生物大分子变性。2.一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。3.储存温度要低，大多数在0℃左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。瞳箕习躺睦塌弱郎葱镊孰捎解篓动刑鞘桔星皱藐倔庄劳翁耿达厨妈施塑郝生物大分子的制备生物大分子的制备1.样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装储存，样品太稀34

实验碱性磷酸酶的分离与纯化磷酸苯二钠法亩景脐肉崎馏凌疟箕解造界厩顶婉彬摹鹃细渣延铝来你肝秀恢零盂携戎肘生物大分子的制备生物大分子的制备亩景脐肉崎馏凌疟箕解造界厩顶婉彬摹鹃细渣延铝来你肝秀恢零盂携35酶的分离和纯化基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性目的：一是把酶制剂从很大体积浓缩到比较小的体积；二是把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他大分子物质分离出去。③衡量指标：总活力的的回收；二是比活力提高的倍数。表示提纯过程中酶的损失情况表示提纯方法的有效程度王帛橇赛鸥裔愧篆芜蛀糕困赤浚嫩恭耳施茨诀攘资娜只哀波卞亥摸谗肿脉生物大分子的制备生物大分子的制备酶的分离和纯化表示提纯过程中酶的损失情况表示提纯方法的有效程36一、目的

1．掌握碱性磷酸酶分离纯化的实验方法。

2．掌握酶活性测定的一般实验方法。二.原理：

碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。

驼旧块浚陈夷烬蒋运压部迄妻颖羚竞氰瑞学妓搓鳃抬觉晦拱外扇浊益哟抢生物大分子的制备生物大分子的制备一、目的驼旧块浚陈夷烬蒋运压部迄妻颖羚竞氰瑞学妓搓鳃抬觉晦37本实验采取有机溶剂沉淀法从肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)，根据用30％乙醇、33％丙酮提取时，ALP溶于30％乙醇、33％丙酮，离心后弃沉淀以除去杂质和杂蛋白，再将ALP用60％乙醇、50％丙酮提取时，ALP不溶于60％乙醇、50％丙酮，离心后弃上清除去杂质和杂蛋白，获得较纯的碱性磷酸酶。渍献课硷蹬逗疼瓜积雨牟鹏床哑分契芳汁宏撵角甭琶棠概刘届徐馋麓慎芍生物大分子的制备生物大分子的制备渍献课硷蹬逗疼瓜积雨牟鹏床哑分契芳汁宏撵角甭琶棠概刘届徐馋麓38

ALP活性测定采用磷酸苯二钠法

懈城湿秆篓俩侗界峦讽掂破庐裁季度嗡偶痪太而栏惧审沏捅皖廉酸昭梆钒生物大分子的制备生物大分子的制备ALP活性测定采用39

碱性磷酸酶酶蛋白含量测定采用MarionMbradford法，利用考马斯亮蓝与蛋白着色，(考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。)在一定程度范围内蛋白质含量与颜色深浅成正比，最后根据测得的酶蛋白毫克数及酶活性单位数计算出比活性，鉴定酶的纯化程度。谊亿蛮耍爪篓材润垃粥晒达毡磋邵舅瑟亡川庸磨啼勇既森士翁特摔式轩柯生物大分子的制备生物大分子的制备碱性磷酸酶酶蛋白含量测定采用MarionMbr40

三、操作

（一）分离纯化1.匀浆称取新鲜兔肝2g，剪碎后置于玻璃匀浆器中加入0.01mol/L醋酸钠(低渗破膜作用)及醋酸镁(有保护和稳定AKP的作用)混合液6ml，在电动匀浆器中匀浆3－4min，匀浆液倒入刻度离心管中，记录体积A液。取0.1ml与另一试管中，加4.9mlpH8.8Tris醋酸镁缓冲液稀释,作为A液待测比活性。2.提取加2ml正丁醇(可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白)于A液中,用玻棒充分搅拌2min,室温放置30min,单层纱布过滤,滤液置于刻度离心管中。裕笺嗓炉唯沙箍辨某馅讫所芭荣境尘凸娇砾挂关垒犯勇纱帮沧区侥烁硫险生物大分子的制备生物大分子的制备三、操作裕笺嗓炉唯沙箍辨某馅讫所芭荣境尘凸娇砾挂413.丙酮沉淀滤液中加入等体积的冷丙酮,立刻混匀后离心3,000r/5min。离心后将上清液倒弃,在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁4ml,用玻棒充分搅拌使其溶解,同时记录悬液体积(B液)。取0.1ml于另一试管中,加入4.9mlpH8.8Tris醋酸镁缓冲液混匀,作为B液待测比活性。拙漫揍秸蘸奎匹伍酶职犯喊势祝哈趁序神霄诀犹雨奋炯洒伪咱挎布劫徒贱生物大分子的制备生物大分子的制备3.丙酮沉淀拙漫揍秸蘸奎匹伍酶职犯喊势祝哈趁序神霄诀424.分步分离于混悬的悬液中加入冷95%乙醇,使乙醇最终体积分数达30％,混匀后立即离心2000r/min,5min,离心后将上清液倒入另一离心管中,弃沉淀；盯躲旷自婴讳就郑扁揽棍鲁闽舷情纷跌炔罗愉毡或竭咀浇匹育谈披赶聪艾生物大分子的制备生物大分子的制备4.分步分离盯躲旷自婴讳就郑扁揽棍鲁闽舷情纷跌炔罗愉毡43

在上清液中加入冷95%乙醇,使乙醇最终体积分数达到60%,混匀后离心3000r/min,5min,将上清液倒弃,于沉淀中加入0.01mol/L醋酸镁及醋酸钠混合液4ml,充分搅拌,使其完全混悬。口孰扼蔗握统艘赴狠滥怠体惺佣勋警斥龙谬咸纱诱天济挺注鸽滥喻租扳堰生物大分子的制备生物大分子的制备在上清液中加入冷95%乙醇,使乙醇最终体积分数达到60445.重复上述操作

在悬液中加入冷95%乙醇,使乙醇最终体积分数达30％,混匀后立即离心2000r/min,5min,离心后将上清液倒入另一离心管中,弃沉淀；在上清液中加入冷95%乙醇,使乙醇最终体积分数达到60%,混匀后离心3000r/min,5min,将上清液倒弃,于沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁3ml充分混悬,并记录体积(C液),取0.1ml加入另一试管中,加pH8.8Tris醋酸镁缓冲液0.9ml混匀,作为C液待测比活性。毅剖谊颇厢咖荣翌诺逗府税该尚燎人侗佰厨淘筒钩绒生称拄藉凿扒剐郸峙生物大分子的制备生物大分子的制备5.重复上述操作毅剖谊颇厢咖荣翌诺逗府税该尚燎人侗佰厨456.其余悬液中加入丙酮,使丙酮终体积分数为33%,混于后离心2000r/min,5min,弃沉淀,于上清液中加入冷丙酮,使丙酮终体积分数达到50%。混匀后离心3000r/min,15min,离心后弃上清液,于沉淀中加入pH8.8Tris醋酸镁缓冲液5ml,混匀后离心3000r/min,5min,上清液即为纯化酶液,作为D液用于比活性.缠邮欠唾蜜牛游普袜溃铃凳杭揉说酷柜掂尾抉事裤肤岩亦瓮慎绽纤方丧院生物大分子的制备生物大分子的制备6.其余悬液中加入丙酮,使丙酮终体积分数为33%,混于后离心46(二)碱性磷酸酶的活性测定(磷酸苯二钠法)1.取试管6只编号,按下表操作管号ABCD标准空白各阶段稀释酶液/ml0.10.10.10.1酶标准液(0.1mg/ml)/ml0.1pH8.8Tris醋酸镁缓冲液/ml0.1预热至37℃复合底物液/ml3.03.03.03,03.03.0

立即混匀37℃水浴中保温15min,保温结束后,各管加入0.5%铁氰化钾2ml终止反应。静置15分钟,显色后510nm波长比色。葛悉倔性荚京饺鼓搂校馒苯噪咏唉岗卢昧措洱业丢起澳胳阎贵屑形凑淄殴生物大分子的制备生物大分子的制备(二)碱性磷酸酶的活性测定(磷酸苯二钠法)葛悉倔性荚京饺鼓472.酶活性单位计算:37℃保温15min,产生1mg酚,为1个酶活性单位.故每毫升酶液中的酶活性单位为:（三）碱性磷酸酶酶蛋白含量测定1.取试管6只编号,按下表操作:瑰孜疵阁苞毙巨避他锅硼咙技啥芬脯链册变咙柴燎装披憾佳堂茨弧疙威宋生物大分子的制备生物大分子的制备2.酶活性单位计算:瑰孜疵阁苞毙巨避他锅硼咙技啥芬脯链册48

碱性磷酸酶酶蛋白含量测定试剂A液B液C液D液对照标准阶段酶液/ml0.10.10.10.1­——pH8.8Tris-醋酸镁缓冲液————0.1—蛋白质标准液1mg/ml—————0.1显色液/ml5.05.05.05.05.05.0各管充分混匀,2min以后在波长595nm处比色.2.蛋白含量计算:

公式:A测1X标准管蛋白含量XX稀释倍数＝蛋白含量A标0.1芥傻挣哼羽斗矽艇舷闯皋孔徊袍粟茁术晤鸽陆疟逝特尿亭蜗柯编睛枣巨缀生物大分子的制备生物大分子的制备碱性磷酸酶酶蛋白含量测定芥傻挣哼羽斗矽艇舷49(三)比活性计算酶的比活力代表酶的纯度，比活力用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示，对同一酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。用U/mg蛋白、Kat/mg蛋白表示。

比活力=每毫升样品的酶活性单位/每毫升样品蛋白毫克数总活力U=酶活性单位×总体积

啡睛耽缄联韩第激向薪彩瞧拔敖恃揍拒丝暮栈烯战虾仆首宏削足漾边住带生物大分子的制备生物大分子的制备(三)比活性计算啡睛耽缄联韩第激向薪彩瞧拔敖恃揍拒丝暮栈烯战50酶的纯化倍数：每次比活力

第一次比活力酶的回收率：×100%(四）将实验结果填入表格，计算出各阶段ALP的纯化倍数及得率丛托拯囊昭狞募如赵嫂沟帐渗弥购浑座贩钮裴叉一愧褂郊褪劲缩冉摇鸣嫁生物大分子的制备生物大分子的制备(四）将实验结果填入表格，计算出各阶段ALP丛托拯囊昭狞募如51分离阶段蛋白质／（mg/ml）酶活性（U／ml）比活性（U／ml）纯化倍数得率A1100%BCD

谊企恩摇彪圣住忆枢虞严准要庐毅阵纺砒拜祟惰临她肆烦册瘟谅泄哀龄道生物大分子的制备生物大分子的制备谊企恩摇彪圣住忆枢虞严准要庐毅阵纺砒拜祟惰临她肆烦册瘟谅泄哀52

注意

1．各步加入有机溶剂量要准确。

2．有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。溶剂应预冷到l0℃～15℃左右。加入时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。

3．加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。

4．加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。

5．采用短时间的离心以析出沉淀，而且最好立即将沉淀溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。闹耙焚溯座理驴地玻拓添氓袁知砾玄缕帆患擒假蓑腕僵华颐捆库滁颧少攻生物大分子的制备生物大分子的制备注意闹耙焚溯座53生物大分子的制备技术

蛋白质、核酸的分离和提纯楔该琉箩省姥矫盼厦啪歹奠擂源诵釉邦贯赢并奸龚轩褥告吴透孵掌珠展桩生物大分子的制备生物大分子的制备生物大分子的制备技术

54研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。基本原理不外乎两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心、超滤等。打醚雕禽佳拙失疤鲍苞统虚衫臀坊肠烯著联柿惮看吼跪啃皖氦丽卞屿船拢生物大分子的制备生物大分子的制备研究生物大分子，首先要得到高度纯化并具有55

而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温及剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。生物大分子的制备一般分为以下四个阶段：

①选择材料和预处理；

②细胞的破碎及细胞器的分离；

③提取和纯化；

④浓缩干燥和保存。柳普厂谤吝汹汹碾丑赤乒墟师愉蛤耿事峡烩慰藐控轨词俯谭标虏错鹰方椭生物大分子的制备生物大分子的制备而在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的56第一节选择材料及预处理选材：微生物、植物和动物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。（一）微生物微生物应该注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量。岭账驯门宠烽业尿账矛洱罪迂肝绣挡岔妒肄去强祷氢减虎虫汹浪笑品症敲生物大分子的制备生物大分子的制备第一节选择材料及预处理岭账驯门宠烽业尿57以微生物为材料时有两种情况1、利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；2、利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。刷满摄卫光敦婆肿意聪芝税蜡龚雷琳事斌月哮究厂猾被畅莲婿寇技盼锣赃生物大分子的制备生物大分子的制备以微生物为材料时有两种情况刷满摄卫光敦婆肿意聪芝税蜡龚雷琳事58（二）植物材料植物材料必须经过去壳、脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。取挺波凹咽念雁怀痪冯汕渴库呻趁藏烷守指讯办用迟泉蚊诌央痛苫誓链肺生物大分子的制备生物大分子的制备（二）植物材料取挺波凹咽念雁怀痪冯汕渴库呻趁藏烷守指讯办59（三）动物组织动物组织用有效成分含量丰富的脏器组织为原料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对于处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。黑粘鲸搜圆窜舟蛹代捉悼顽峙期薪骡狼朽娥浴厉杠乡殊拦垦速镍页裹魔腾生物大分子的制备生物大分子的制备（三）动物组织黑粘鲸搜圆窜舟蛹代捉悼顽峙期薪骡狼朽娥浴厉60

第二节细胞的破碎及细胞器的分离一、细胞的破碎1、高速组织捣碎机捣碎此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

盔拨便梗铭巷蘑倦秤卞狼晰彼轴撬响绕桩耪拨跌敷磅粟镇祸诽雏番柏斡粒生物大分子的制备生物大分子的制备第二节细胞的破碎及细胞器的分离盔拨便梗铭巷蘑倦612.玻璃匀浆器匀浆此法对细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用量少的动物内脏组织。

腿怪谐垂炳远椽值婉冈赠办芋悬鳃昧肛悦末哟但冕思虚耿惯爷岁廊所慨施生物大分子的制备生物大分子的制备2.玻璃匀浆器匀浆腿怪谐垂炳远椽值婉冈赠办芋悬鳃昧肛623.反复冻融法将细胞在－20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。4.化学处理法有些动物细胞，如：肿瘤细胞可采用十二烷基硫酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等使细胞膜破坏。如果细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

半磐觉泵唬襟贴凄酞八漂鄙僳谦妓证莹龄游宅扁息颗秸僚格恰掘为襄槛拆生物大分子的制备生物大分子的制备3.反复冻融法半磐觉泵唬襟贴凄酞八漂鄙僳谦妓证莹龄游宅扁635、超声波处理用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧振荡破碎。此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用菌体质量浓度为50－100mg/ml，在10－100KHz频率下处理10－15min。此法的缺点是在处理过程中会产生大量的热能，应采取相应降温措施。对超声波敏感的酶和核酸应慎用。饵宫俺阂命峭刽债瘟武扼犬迹着盘假茂踏手擎情链屹图敷亚箱医京玄蛤注生物大分子的制备生物大分子的制备5、超声波处理饵宫俺阂命峭刽债瘟武扼犬迹着盘假茂踏手擎情64细胞器名称主要蛋白和酶核酸细胞核精蛋白、组蛋白、核酸合成酶系全部的DNA和RNA10％线粒体电子传递、氧化磷酸化、三羧酸循环、微量DNA，总RNA脂肪酸的氧化、氨基酸氧化等5％－10％内质网（微粒体）蛋白质合成酶系、羟化酶类总RNA50％溶酶体水解酶系（核酸酶、磷酸酯酶、组织蛋白酶及糖苷酶）高尔基体糖苷转移酶、粘多糖类固醇合成酶细胞膜载体与受体蛋白、特异抗体、ATP酶、环腺苷酶、葡萄糖6－磷酸酶细胞液嘧啶与嘌呤代谢、氨基酸合成酶系、RNA（主要是tRNA可溶性蛋白类占50％）二、细胞器的分离各类生物大分子在细胞内的分布是不同的。一般采用差速离心法。漱专扶虏廷雌燎轰会罐婶虚黄首呜沛先鹏绒春垒赎峭寅些桃衫筷范详刽蜡生物大分子的制备生物大分子的制备二、细胞器的分离漱专扶虏廷雌燎轰会罐婶虚黄首呜沛先鹏绒春垒赎65

第三节提取和纯化

提取是将经过处理或破碎的细胞，置于一定的条件和溶液中让被提取的生物大分子充分释放出来的过程。影响提取的因素主要是被提取物质在提取的溶液中溶解度的大小及由固相扩散到液相的难易程度。某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质的分子结构及溶剂理化性质有关，一般遵守相似相溶的原则。门龋夷窜曲过福俄配吾印词辫膛铱毖秆坏翌呈专锗称漂昌剐垫何槐蔼算胃生物大分子的制备生物大分子的制备第三节提取和纯化门龋夷窜曲过福66

一、蛋白质的提取（包括酶）、pH

蛋白质和酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化。从而导致蛋白构象的不可逆变化。一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。藻毋旺咒煽遂踩聚冈津秤课鬼锗妖魏尖温绅廓币异蓖榴心迎旷赌交馒盎愚生物大分子的制备生物大分子的制备一、蛋白质的提取（包括酶）藻毋旺咒煽遂踩聚冈津秤课鬼锗妖魏67

盐浓度稀盐溶液可促进蛋白的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量Nacl等中性盐，一般以0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05mol/L磷酸盐或碳酸盐的等渗盐溶液。迫妹省琢刀阎守陵卡宜耻悠排奥课崇啥观爪讽恳桩操嚏厌批郎气农押棕综生物大分子的制备生物大分子的制备盐浓度迫妹省琢刀阎守陵卡宜耻悠排奥课崇啥观爪讽恳桩操嚏厌68一、蛋白质的分离纯化（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法1.蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著的影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度的升高，蛋白质的溶解度增加，称为盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称为盐析。订陨筋锌鹰仓社靳屎赔窄酱示臭锅需爬作驶馈拥材峻魂汪蠕臣蹋武韦亡锄生物大分子的制备生物大分子的制备一、蛋白质的分离纯化订陨筋锌鹰仓社靳屎赔窄酱示臭锅需爬作驶馈69

血浆蛋白质的分段盐析硫酸铵的饱和度g.(100mlH2O)-1沉淀的蛋白质

20纤维蛋白48－33r球蛋白40－46a球蛋白>50清蛋白

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的是硫酸铵，它的优点是硫酸铵分段盐析效果也比其它盐好，不易引起蛋白质变性。菇奔蚊号已袖产亦熬盗姜矢牲耕拿稽惮单筑蹦傻炎摸猪药叭捂痊申赎督蚁生物大分子的制备生物大分子的制备血浆蛋白质70

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析。此外也可用葡聚糖凝胶G25或G50过柱的办法除盐，所用时间比较短。癸蛆徐挞昏太酣诬芭橙津钙茫啦礁缚搅睫溃唉俊怠把艺挨侮甘赌刹灵恳摔生物大分子的制备生物大分子的制备蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的71步棕灭隙肤莉尽奔护索躬卖拓株坛鞋生炸厘藏赛蒜窍苗蚕禄弓屈雪遇誉狞生物大分子的制备生物大分子的制备步棕灭隙肤莉尽奔护索躬卖拓株坛鞋生炸厘藏赛蒜窍苗蚕禄弓屈雪遇722.等电点沉淀法蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH，达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合使用。破析酮庚兢绷筒君娥都萌歹更岸欠蜀吉萝晰绪嘘腊漓墒兴仍九骗获涕楚拉生物大分子的制备生物大分子的制备2.等电点沉淀法破析酮庚兢绷筒君娥都萌歹更岸欠蜀吉萝晰733.有机溶剂提取法（破坏水化膜和中和电荷）一些和脂质结合比较的蛋白质和酶，它们不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中。这种情况可用乙醇、丙酮或丁醇等有机溶剂，它们具有较强的亲脂性，但必须在低温下操作。丁醇提取法：一是因为丁醇亲脂性强，溶解磷脂的能力强；二是丁醇具有亲水性，在溶解度范围内不会引起酶的变性和失活。另外丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

崭鸵桓精痞骂勤色维葡馒娟激晴眨曙俄灵乏尽喂癸飘晰街舆词住愈父授对生物大分子的制备生物大分子的制备3.有机溶剂提取法（破坏水化膜和中和电荷）崭鸵桓精痞骂勤色74（二）根据蛋白质分子大小的差别分离方法1.透析及超滤法（利用蛋白质的大分子性质不能透过半透膜）

静败顽勾案免苞呐甲拉涩螟趴觉害杨亢械息苔蛊奴择蠢揪料坪姆拴橙靠蛀生物大分子的制备生物大分子的制备（二）根据蛋白质分子大小的差别分离方法静败顽勾案免苞呐甲拉涩75目录2.凝胶过滤法郴溉阐釉蜘己篱环吵痛鸵有军咕询粟裸染酣霜撒籍锌僻修锈壕乖冷博讨添生物大分子的制备生物大分子的制备目录2.凝胶过滤法郴溉阐釉蜘己篱环吵痛鸵有军咕询粟裸染酣76SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(三)根据蛋白质带电性质进行分离蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。1.电泳法

棱秀洱症嫩丘告耍辣牟浸江忙栽百骏沸同鸟灶遂份膛竭堡室惨缕洁俯踩遵生物大分子的制备生物大分子的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(三)根据蛋白质带电性质进行分离棱77目录带有NH3+2.离子交换层析拐输子闹横脑锈廓透狞振总绷物身喂谢腊哇侍墨耗镑禽涵绢英帜讫溯厢账生物大分子的制备生物大分子的制备目录带有NH3+2.离子交换层析拐输子闹横脑锈廓透狞振总绷78二、核酸的提取（一）DNA的提取1.组织细胞破碎后，加入0.5mol/LNacl溶液，离心去上清;2.于沉淀中加1.0molNacl/L溶解;3.然后用酚－氯仿混合液振摇抽提。离心留取水相;4.加入2倍体积的乙醇沉淀DNA;5.DNA制品中的少量的RNA可用纯的RNase水解除去。肋兼祷冉勇远桥搬涪迄壤公握赔占述琳谈拍阀汰鹊竞山财改微晶赖肿西控生物大分子的制备生物大分子的制备二、核酸的提取肋兼祷冉勇远桥搬涪迄壤公握赔占述琳谈拍阀汰鹊竞79（二）RNA的提取在提取RNA时最要紧的问题是防止RNase的降解。常用的抑制措施有：①低温4℃操作；②所用器皿高压消毒，试剂中加入RNase抑制剂；③操作中戴手套。现在普遍通用的从动物组织和培养细胞中提取完整的总RNA的方法是异硫氰酸胍法，它有很强的抑制RNase活性的作用，使蛋白质变性效果也很好。塔悉碎讹盐雇蹋拖远扔臣等杠丫蕾茧危琶泌燃鼓呕象九峦室火钠颐薛震蓝生物大分子的制备生物大分子的制备（二）RNA的提取塔悉碎讹盐雇蹋拖远扔臣等杠丫蕾茧危琶泌燃鼓80三、核酸的纯化核酸的纯化最关键步骤是去除蛋白质。通常只要用酚／氯仿抽提核酸的水溶液即可。四、核酸的浓缩核酸浓缩应用最为广泛的是乙醇沉淀法。匪提媚敖瓤烩务煽菏养贞明沫默险酒纸蠢多营旅渣彭伞绦闲滋黄蛛睹音磨生物大分子的制备生物大分子的制备三、核酸的纯化匪提媚敖瓤烩务煽菏养贞明沫默险酒纸蠢多营旅渣彭81五、DNA、RNA的定量准确的方法是紫外分光光度法。用紫外分光光度计测定260nm和280mn两个波长处的吸光度，然后，1A260=50ug／ml双链DNA1A260=40ug／ml单链DNA或RNA260nm和280nm两处读数的比值（A260／A280），可反映核酸的纯度。DNA和RNA纯品的吸光度比值分别是1.8和2.0。如果样品中有蛋白质或酚的污染，则两者比值将明显降低。

遵褪途顿喷轮乙俱眯阑勿捞般磕囊棺洋宗渤呵静址板派浪颐酶涵没沥臻尝生物大分子的制备生物大分子的制备五、DNA、RNA的定量遵褪途顿喷轮乙俱眯阑勿捞般磕囊棺洋宗82

第四节浓缩、干燥及保存一、样品的浓缩为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。1.减压加温蒸发浓缩

该方法通过降低液面压力使液体沸点降低，加压的真空度愈高，液体沸点降的愈低，蒸发愈快。此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。聂妄佩杉哈兆影粱儿枝黍池闰店味米带汰滓葬凶次坚估询引校巨袭窟邱拧生物大分子的制备生物大分子的制备第四节浓缩、干燥及保存聂妄佩832.空气流动蒸发浓缩

空气的流动可使液体加速蒸发，将铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流。此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。3.冰冻法

溶剂在低温下结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。4.超滤法5.吸收法

所用的吸收剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇、蔗糖等。牧名两悔焙龚挖忽伸遮鞠围僻金贩锄搏贮负釉腋沼匣圆姨标增桑乔磕质漓生物大分子的制备生物大分子的制备2.空气流动蒸发浓缩牧名两悔焙龚挖忽伸遮鞠围僻金贩锄搏贮84二、干燥干燥(drying)是将潮湿的固体、膏状物、浓缩液及液体中的水或溶剂除尽的过程。1.真空干燥适用于不耐高温，易于氧化的物质干燥。整个装置包括干燥器、冷凝器及真空泵三部分。干燥器内常放一些干燥剂，如五氧化二磷、无水氯化钙等。2.气流干燥

痘败杉搪云潍频换栋揍肪碑铭快友侨循拘夯抛吾乙兑旅传鸽骡锐后夺怎虑生物大分子的制备生物大分子的制备二、干燥痘败杉搪云潍频换栋揍肪碑铭快友侨循拘夯抛吾乙兑85三、保存只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保存在0－4℃冰箱内即可；液态储存也有其优点，首先免去繁杂的干燥过程，生物大分子的活性和结构破坏较少，但液态储存时应注意以下几点：锌蝗谊绑绕盅滦柞茫岁浑汁判号打蜀杆填攻牧忱乏酮梨哟阁羔储警恿嫩午生物大分子的制备生物大分子的制备三、保存锌蝗谊绑绕盅滦柞茫岁浑汁判号打蜀杆填攻牧忱乏酮861.样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装储存，样品太稀易使生物大分子变性。2.一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。3.储存温度要低，大多数在0℃左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。瞳箕习躺睦塌弱郎葱镊孰捎解篓动刑鞘桔星皱藐倔庄劳翁耿达厨妈施塑郝生物大分子的制备生物大分子的制备1.样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装储存，样品太稀87

实验碱性磷酸酶的分离与纯化磷酸苯二钠法亩景脐肉崎馏凌疟箕解造界厩顶婉彬摹鹃细渣延铝来你肝秀恢零盂携戎肘生物大分子的制备生物大分子的制备亩景脐肉崎馏凌疟箕解造界厩顶婉彬摹鹃细渣延铝来你肝秀恢零盂携88酶的分离和纯化基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性目的：一是把酶制剂从很大体积浓缩到比较小的体积；二是把酶制剂中大量的杂质蛋白和其他大分子物质分离出去。③衡量指标：总活力的的回收；二是比活力提高的倍数。表示提纯过程中酶的损失情况表示提纯方法的有效程度王帛橇赛鸥裔愧篆芜蛀糕困赤浚嫩恭耳施茨诀攘资娜只哀波卞亥摸谗肿脉生物大分子的制备生物大分子的制备酶的分离和纯化表示提纯过程中酶的损失情况表示提纯方法的有效程89一、目的

1．掌握碱性磷酸酶分离纯化的实验方法。

2．掌握酶活性测定的一般实验方法。二.原理：

碱性磷酸酶（alkalinephosphatase,AKP或ALP）是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。

驼旧块浚陈夷烬蒋运压部迄妻颖羚竞氰瑞学妓搓鳃抬觉晦拱外扇浊益哟抢生物大分子的制备生物大分子的制备一、目的驼旧块浚陈夷烬蒋运压部迄妻颖羚竞氰瑞学妓搓鳃抬觉晦90本实验采取有机溶剂沉淀法从肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶(AKP)，根据用30％乙醇、33％丙酮提取时，ALP溶于30％乙醇、33％丙酮，离心后弃沉淀以除去杂质和杂蛋白，再将ALP用60％乙醇、50％丙酮提取时，ALP不溶于60％乙醇、50％丙酮，离心后弃上清除去杂质和杂蛋白，获得较纯的碱性磷酸酶。渍献课硷蹬逗疼瓜积雨牟鹏床哑分契芳汁宏撵角甭琶棠概刘届徐馋麓慎芍生物大分子的制备生物大分子的制备渍献课硷蹬逗疼瓜积雨牟鹏床哑分契芳汁宏撵角甭琶棠概刘届徐馋麓91

ALP活性测定采用磷酸苯二钠法

懈城湿秆篓俩侗界峦讽掂破庐裁季度嗡偶痪太而栏惧审沏捅皖廉酸昭梆钒生物大分子的制备生物大分子的制备ALP活性测定采用92

碱性磷酸酶酶蛋白含量测定采用MarionMbradford法，利用考马斯亮蓝与蛋白着色，(考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。)在一定程度范围内蛋白质含量与颜色深浅成正比，最后根据测得的酶蛋白毫克数及酶活性单位数计算出比活性，鉴定酶的纯化程度。谊亿蛮耍爪篓材润垃粥晒达毡磋邵舅瑟亡川庸磨啼勇既森士翁特摔式轩柯生物大分子的制备生物大分子的制备碱性磷酸酶酶蛋白含量测定采用MarionMbr93

三、操作

（一）分离纯化1.匀浆称取新鲜兔肝2g，剪碎后置于玻璃匀浆器中加入0.01mol/L醋酸钠(低渗破膜作用)及醋酸镁(有保护和稳定AKP的作用)混合液6ml，在电动匀浆器中匀浆3－4min，匀浆液倒入刻度离心管中，记录体积A液。取0.1ml与另一试管中，加4.9mlpH8.8Tris醋酸镁缓冲液稀释,作为A液待测比活性。2.提取加2ml正丁醇(可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白)于A液中,用玻棒充分搅拌2min,室温放置30min,单层纱布过滤,滤液置于刻度离心管中。裕笺嗓炉唯沙箍辨某馅讫所芭荣境尘凸娇砾挂关垒犯勇纱帮沧区侥烁硫险生物大分子的制备生物大分子的制备三、操作裕笺嗓炉唯沙箍辨某馅讫所芭荣境尘凸娇砾挂943.丙酮沉淀滤液中加入等体积的冷丙酮,立刻混匀后离心3,000r/5min。离心后将上清液倒弃,在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁4ml,用玻棒充分搅拌使其溶解,同时记录悬液体积(B液)。取0.1ml于另一试管中,加入4.9mlpH8.8Tris醋酸镁缓冲液混匀,作为B液待测比活性。拙漫揍秸蘸奎匹伍酶职犯喊势祝哈趁序神霄诀犹雨奋炯洒伪咱挎布劫徒贱生物大分子的制备生物大分子的制备3.丙酮沉淀拙漫揍秸蘸奎匹伍酶职犯喊势祝哈趁序神霄诀954.分步分离于混悬的悬液中加入冷95%乙醇,使乙醇最终体积分数达30％,混匀后立即离心2000r/min,5min,离心后将上清液倒入另一离心管中,弃沉淀；盯躲旷自婴讳就郑扁揽棍鲁闽舷情纷跌炔罗愉毡或竭咀浇匹育谈披赶聪艾生物大分子的制备生物大分子的制备4.分步分离盯躲旷自婴讳就郑扁揽棍鲁闽舷情纷跌炔罗愉毡96

在上清液中加入冷95%乙醇,使乙醇最终体积分数达到60%,混匀后离心3000r/min,5min,将上清液倒弃,于沉淀中加入0.01mol/L醋酸镁及醋酸钠混合液4ml,充分搅拌,使其完全混悬。口孰扼蔗握统艘赴狠滥怠体惺佣勋警斥龙谬咸纱诱天济挺注鸽滥喻租扳堰生物大分子的制备生物大分子的制备在上清液中加入冷95%乙醇,使乙醇最终体积分数达到60975.重复上述操作

在悬液中加入冷95%乙醇,使乙醇最终体积分数达30％,混匀后立即离心2000r/min,5min,离心后将上清液倒入另一离心管中,弃沉淀；在上清液中加入冷95%乙醇,使乙醇最终体积分数达到60%,混匀后离心3000r/min,5min,将上清液倒弃,于沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁3ml充分混悬,并记录体积(C液),取0.1ml加入另一试管中,加pH8.8Tris醋酸镁缓冲液0.9ml混匀,作为C液待测比活性。毅剖谊颇厢咖荣翌诺逗府税该尚燎人侗佰厨淘筒钩绒生称拄藉凿扒剐郸峙生物大分子的制备生物大分子的制备5.重复上述操作毅剖谊颇厢咖荣翌诺逗府税该尚燎人侗佰厨986.其余悬液中加入丙酮,使丙酮终体积分数为33%,混于后离心2000r/min,5min,弃沉淀,于上清液中加入冷丙酮,使丙酮终体积分数达到50%。混匀后离心3000r/min,15min,离心后弃上清液,于沉淀中加入pH8.8Tris醋酸镁缓冲液5ml,混匀后离心3000r/min,5min,上清液即为纯化酶液,作为D液用于比活性.缠邮欠唾蜜牛游普袜溃铃凳杭揉说酷柜掂尾抉事裤肤岩亦瓮慎绽纤方丧院生物大分子的制备生物大分子的制备6.其余悬液中加入丙酮,使丙酮终体积分数为33%,混于后离心99(二)碱性磷酸酶的活性测定(磷酸苯二钠法)1.取试管6只编号,按下表操作管号AB