沙门氏菌检验详细流程课件

GB4789.4-2010

食品安全国家标准

食品微生物学检验沙门氏菌检验

-GB4789.4-2010

食品安全国家标准

食品微生物学1沙门菌概况沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门菌属。沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌有2500多个血清型和变种。我国发现的有250多个血清型。-沙门菌概况沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时2沙门菌的分类根据生化反应不同，分为2个种：肠道沙门菌（Samonellaenterica）： Ⅰ肠道亚种（subsp.enterica）Ⅱ萨拉姆亚种

（subsp.salamae）Ⅲ亚利桑那亚种（subsp.arizonae）

Ⅳ豪顿亚种（subsp.houtenae）Ⅵ因迪卡亚种（subsp.indica）邦戈尔沙门菌（Samonellabongori）Ⅴ

-沙门菌的分类根据生化反应不同，分为2个种：-3沙门菌种和亚种的鉴别项目肠道沙门菌邦戈尔沙门菌ⅠⅡⅢⅣⅥⅤ卫矛醇＋＋－－－＋山梨醇＋＋＋＋－＋水杨苷－－－＋－－ONPG－－＋－－＋丙二酸盐－＋＋－－－KCN－－－＋－＋注：+为阳性-为阴性-沙门菌种和亚种的鉴别项目肠道沙门菌邦戈尔沙门菌ⅠⅡⅢⅣⅥⅤ卫4沙门氏菌的血清分型迄今为止沙门氏菌有57个O抗原116个H抗原Vi抗原

被分成2500多个血清型。Vi抗原O抗原H抗原-沙门氏菌的血清分型迄今为止沙门氏菌有Vi抗原O抗原H抗原-5沙门氏菌命名与书写方式目前的命名方法规定：肠道沙门菌肠道亚种（亚种Ⅰ）给予专用名，并采用标本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且亚种Ⅰ的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠伤寒血清型应书写为Salmonellaentericasubsp.entericaserotypeTyphimurium，但在实际工作中，可简写为S.Typhimurium。其他沙门氏菌均不给专用名，只在亚种数字名后直接书写抗原式，比如S.Ⅴ66:z35:-新的血清型名称的批准必须有巴斯德研究所、德国汉堡卫生研究所及美国CDC3个实验室的一致同意。-沙门氏菌命名与书写方式目前的命名方法规定：-6沙门氏菌检验程序-沙门氏菌检验程序-7目的：修复损伤的细菌细胞；方法：25g（mL）样品＋225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如使用均质袋，可直接进行培养。于36℃±1℃培养8h～18h。前增菌-目的：修复损伤的细菌细胞；前增菌-8无菌均质袋-无菌均质袋-9轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL,转种于10mLTTB内,于42±1℃培养18～24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36±1℃培养18～24h。分别用接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或显色培养基平板）。于36±1℃分别培养18～24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、显色培养基平板)或40h～48h(BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。

选择性增菌与分离-轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL,转种于10mL10分离培养基回收率测定（%）进口-SS65.3进口-SS81.0国产-SS52.0进口-HE83.2国产-HE80.0进口-XLD83.0国产-XLD86.2进口-BS106.6国产-BS77.7CHRO显色68.4国产-DHL98.4国产-WS71.6TSA（对照）100.0-分离培养基回收率测定（%）进口-SS65.3进口-SS8111典型菌落--BS

菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。国产BS进口BS-典型菌落--BS菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色12典型菌落--HE国产HE进口HE蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。-典型菌落--HE国产HE进口HE蓝绿色或蓝色,多数菌落中心13典型菌落--XLD进口XLD国产XLD菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心-典型菌落--XLD进口XLD国产XLD菌落呈粉红色，带或不带14初筛微生物菌落颜色特异性灵敏度沙门氏菌紫色(直径约1mm)89％100%柠檬酸杆菌属蓝色(直径约1mm)---变形杆菌无色或被抑制---(铜绿假单胞菌也呈紫红色，可以通过前增菌排除。所以推荐在检测中的前增菌用TTB。粉红色、深红色、干燥菌落、边缘锯齿状等均非沙门氏菌菌落。）-初筛微生物菌落颜色特异性灵敏度沙门氏菌紫色(直径约1mm)815生化试验

自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板；取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层。接种针在接种TSI后不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃培养18～24h，必要时可延长至48h。-生化试验自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，16穿刺TSI方法-穿刺TSI方法-17接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h,必要时可延长至48h。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。-接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白18沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果

三糖铁琼脂

赖氨酸脱羧酶试验培养基

初步判断

斜面

底层

产气

硫化氢

-+＋（－）

＋（－）

＋可疑沙门氏菌属

-+＋（－）

＋（－）

－可疑沙门氏菌属

++＋（－）

＋（－）

＋可疑沙门氏菌属

++＋/－

＋/－

－非沙门氏菌

注：＋阳性，－阴性；＋（－）多数阳性,少数阴性；＋/－阳性或阴性。

该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。-沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果

斜面底层19TSI的反应赖氨酸脱羧酶试验-TSI的反应20沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

反应序号

硫化氢

（H2S）

靛基质

pH7.2尿素

氰化钾

（KCN）

赖氨酸脱羧酶

A1＋

－

－

－

＋

A2＋

＋

－

－

＋

A3－

－

－

－

＋/－

注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。

反应序号A1：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按下表可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。

-沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）21沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

pH7.2尿素

氰化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶

判

定

结

果

－

－

－

甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)＋－＋沙门氏菌个别变体(要求血清学鉴定结果)注：＋表示阳性；＋表示阴性。

反应序号2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门菌靛基质阳性变体两项结果均为阳性；反应序号3：补做ONPG，ONPG阴性，同时赖氨酸脱羧酶阳性为沙门菌；但甲型副伤寒沙门菌赖氨酸脱羧酶为阴性。-沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH7.2尿素氰化钾(K22沙门氏菌属各生化群的鉴别

必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定

项

目

ⅠⅡⅢⅣⅤⅥ卫矛醇

＋

＋

－

－

＋

－

山梨醇＋＋＋＋＋－水杨苷－－－＋－－ONPG－－＋－＋－丙二酸盐－＋＋－－－KCN－－－＋＋－注：＋表示阳性;－表示阴性。

-沙门氏菌属各生化群的鉴别

必要时按此表进行沙门菌生化群鉴定23沙门菌的其他鉴定API20EVITEK32GNI＋卡片-沙门菌的其他鉴定API20E-24沙门菌的血清学鉴定培养基：一般使用新鲜营养琼脂斜面作纯培养，取斜面上部培养物作O抗原玻片凝集试验，下部凝结水里的培养物作H抗原。H抗原的位相诱导试验制备半固体琼脂，融化完全分装10ml/管，121℃灭菌15分钟，冷至50℃备用。取诱导用血清1滴加到小平皿中，倾入冷至50℃的10ml半固体琼脂，轻轻摇匀，凝固。将培养物接种到平板的中央，放入湿盒中培养过夜。取边缘的菌进行H抗原的检测。-沙门菌的血清学鉴定培养基：一般使用新鲜营养琼脂斜面作纯培养，25血清学鉴定时的注意要点：做血清凝集时，同时应用生理盐水做对照。O血清不凝集时，可将菌株转接于琼脂量较高(如2.5%-3%)的斜面上，再做凝集。如果由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原的凝集反应时，应挑取菌苔于1mL生理盐水中做成菌悬液。煮沸后再检查。(常见于伤寒沙门菌)。有极少数的二相沙门菌会同时出现2相H抗原，也有一些沙门氏菌在培养过程中H抗原会出现第1项和第2项之间的转变，所以血清诱导实验要用新鲜的培养物进行诱导。-血清学鉴定时的注意要点：-26谢谢大家!-谢谢大家!-27GB4789.4-2010

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食品安全国家标准

食品微生物学28沙门菌概况沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时，分离出的猪霍乱沙门菌，由于Salmon氏对本属细菌的发现贡献卓越，故定名为沙门菌属。沙门菌属是肠杆菌科中最重要的病原菌。它是一群抗原结构、生化特性相似的革兰氏阴性杆菌。血清型繁多，目前已发现的沙氏菌有2500多个血清型和变种。我国发现的有250多个血清型。-沙门菌概况沙门菌是1885年由Salmon氏等在猪霍乱流行时29沙门菌的分类根据生化反应不同，分为2个种：肠道沙门菌（Samonellaenterica）： Ⅰ肠道亚种（subsp.enterica）Ⅱ萨拉姆亚种

（subsp.salamae）Ⅲ亚利桑那亚种（subsp.arizonae）

Ⅳ豪顿亚种（subsp.houtenae）Ⅵ因迪卡亚种（subsp.indica）邦戈尔沙门菌（Samonellabongori）Ⅴ

-沙门菌的分类根据生化反应不同，分为2个种：-30沙门菌种和亚种的鉴别项目肠道沙门菌邦戈尔沙门菌ⅠⅡⅢⅣⅥⅤ卫矛醇＋＋－－－＋山梨醇＋＋＋＋－＋水杨苷－－－＋－－ONPG－－＋－－＋丙二酸盐－＋＋－－－KCN－－－＋－＋注：+为阳性-为阴性-沙门菌种和亚种的鉴别项目肠道沙门菌邦戈尔沙门菌ⅠⅡⅢⅣⅥⅤ卫31沙门氏菌的血清分型迄今为止沙门氏菌有57个O抗原116个H抗原Vi抗原

被分成2500多个血清型。Vi抗原O抗原H抗原-沙门氏菌的血清分型迄今为止沙门氏菌有Vi抗原O抗原H抗原-32沙门氏菌命名与书写方式目前的命名方法规定：肠道沙门菌肠道亚种（亚种Ⅰ）给予专用名，并采用标本分离地址的地名。菌名的第一个字母需大写，且亚种Ⅰ的所用菌名不能用斜体。例如：肠道沙门菌鼠伤寒血清型应书写为Salmonellaentericasubsp.entericaserotypeTyphimurium，但在实际工作中，可简写为S.Typhimurium。其他沙门氏菌均不给专用名，只在亚种数字名后直接书写抗原式，比如S.Ⅴ66:z35:-新的血清型名称的批准必须有巴斯德研究所、德国汉堡卫生研究所及美国CDC3个实验室的一致同意。-沙门氏菌命名与书写方式目前的命名方法规定：-33沙门氏菌检验程序-沙门氏菌检验程序-34目的：修复损伤的细菌细胞；方法：25g（mL）样品＋225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如使用均质袋，可直接进行培养。于36℃±1℃培养8h～18h。前增菌-目的：修复损伤的细菌细胞；前增菌-35无菌均质袋-无菌均质袋-36轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL,转种于10mLTTB内,于42±1℃培养18～24h。同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36±1℃培养18～24h。分别用接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或显色培养基平板）。于36±1℃分别培养18～24h(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、显色培养基平板)或40h～48h(BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。为了最大可能的检出沙门氏菌，原则上必须使用两种以上选择性分离培养基。

选择性增菌与分离-轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL,转种于10mL37分离培养基回收率测定（%）进口-SS65.3进口-SS81.0国产-SS52.0进口-HE83.2国产-HE80.0进口-XLD83.0国产-XLD86.2进口-BS106.6国产-BS77.7CHRO显色68.4国产-DHL98.4国产-WS71.6TSA（对照）100.0-分离培养基回收率测定（%）进口-SS65.3进口-SS8138典型菌落--BS

菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落,周围培养基不变。国产BS进口BS-典型菌落--BS菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色39典型菌落--HE国产HE进口HE蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色。-典型菌落--HE国产HE进口HE蓝绿色或蓝色,多数菌落中心40典型菌落--XLD进口XLD国产XLD菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心-典型菌落--XLD进口XLD国产XLD菌落呈粉红色，带或不带41初筛微生物菌落颜色特异性灵敏度沙门氏菌紫色(直径约1mm)89％100%柠檬酸杆菌属蓝色(直径约1mm)---变形杆菌无色或被抑制---(铜绿假单胞菌也呈紫红色，可以通过前增菌排除。所以推荐在检测中的前增菌用TTB。粉红色、深红色、干燥菌落、边缘锯齿状等均非沙门氏菌菌落。）-初筛微生物菌落颜色特异性灵敏度沙门氏菌紫色(直径约1mm)842生化试验

自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，分别接种三糖铁（TSI）琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板；取菌落一部分于斜面划线后穿刺底层。接种针在接种TSI后不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃培养18～24h，必要时可延长至48h。-生化试验自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，43穿刺TSI方法-穿刺TSI方法-44接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h～24h,必要时可延长至48h。将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。-接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白45沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果

三糖铁琼脂

赖氨酸脱羧酶试验培养基

初步判断

斜面

底层

产气

硫化氢

-+＋（－）

＋（－）

＋可疑沙门氏菌属

-+＋（－）

＋（－）

－可疑沙门氏菌属

++＋（－）

＋（－）

＋可疑沙门氏菌属

++＋/－

＋/－

－非沙门氏菌

注：＋阳性，－阴性；＋（－）多数阳性,少数阴性；＋/－阳性或阴性。

该表显示：只有在三糖铁斜面产酸、底层产酸；同时赖氨酸阴性的菌株可排除。其他反应结果均有沙门菌属的可能，同时也均有不是沙门菌的可能。-沙门氏菌属的三糖铁和赖氨酸脱羧酶试验结果

斜面底层46TSI的反应赖氨酸脱羧酶试验-TSI的反应47沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

反应序号

硫化氢

（H2S）

靛基质

pH7.2尿素

氰化钾

（KCN）

赖氨酸脱羧酶

A1＋

－

－

－

＋

A2＋

＋

－

－

＋

A3－

－

－

－

＋/－

注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。

反应序号A1：为典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常,按下表可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。

-沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢（H2S）48沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

pH7.2尿素

氰化钾(KCN)赖氨酸脱羧酶

判

定

结

果

－

－

－

甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符合本群生化特性)＋－＋