浅谈胶原蛋白

浅谈胶原蛋白10化基杨景舒结构和性质分类及制备SDS分析123我们生活中的胶原蛋白前言胶原蛋白富含除色氨酸和半胱氨酸外的18种氨基酸，其中维持人体生长所必需的氨基酸有7种，胶原蛋白中的甘氨酸占30％，脯氨酸和羟脯氨酸共占25％，是各种蛋白质中含量最高的，丙氨酸、谷氨酸的含量也比较高，同时还含有在一般蛋白中少见的羟脯氨酸和焦谷氨酸。胶原蛋白结构胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白质，分子量为300kD，其分子在细胞外基质中聚集为超分子结构。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，由3条a链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，它们交叉相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺旋结构独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定，并且具有低免疫原性和良好的生物相容性等。结构决定性质，性质决定用途，胶原蛋白的结构的多样性和复杂性决定其在许多领域的重要地位。王丽娜，黄素珍.胶原蛋白的研究进展，肉类研究，2010.1性质胶原蛋白生物学性质低免疫原性生物相容性可生物降解性止血和修复功能生物学性质——低免疫原性林炜等认为胶原有三种类型的抗原分子,第一类是胶原肽链非螺旋的端肽,第二类是胶原的三股螺旋的构象,第三类是a-链螺旋区的氨基酸顺序。其中第二类抗原因子仅存在于天然胶原分子中,第三类只出现在变性胶原中,而第一类抗原因子在天然和变性胶原中均存在。林炜，穆畅道，王坤余，等.皮革固体废弃物资源化Ⅱ-胶原的性质及其在医药和化妆品工业中的应用[J].中国皮革，2001，30（15）：8-11.生物学性质——生物相容性生物相容性是指胶原与宿主细胞及组织之间良好的相互作用。无论是在被吸收前作为新组织的骨架,还是被吸收同化进入宿主成为宿主的一部分,都与细胞周围的基质有着良好的相互作用,表现出相互影响的协调性,并成为细胞与组织正常生理功能整体的一部分Zhen-sheng等人发现胶原聚合材料具有高度的生物相容性。黎洪棉等人研究表明：海绵状I型胶原蛋白与兔脂肪干细胞具有良好的体外生物相容性，能为组织工程种子细胞的生长提供适宜的三维空间，可作为脂肪组织工程种子细胞的载体材料。王娜.酶法提取猪皮胶原的工艺研究[D].四川大学硕士学位论文，200.GuZhen-sheng,ShengYao-hua,WangLi-tian,etal.Biocompatibilityresearchofthecollagen-polymerashumanimplants[J].ChineseJournalofClinicalRehabilitation,2005,9(6):247-249.黎洪棉，高建华，鲁峰，等.李海绵状I型胶原蛋白与免脂肪干细胞的生物相容[J].中国组织工程研究与临床康复，2009，25（13）：4829-4833.生物学性质——可生物降解性胶原能被特定的蛋白酶降解,即生物降解性。因胶原具有紧密牢固的螺旋结构,所以绝大多数蛋白酶只能切断其侧链,只有特定的蛋白酶在特定的条件下才能降解胶原蛋白,胶原肽键才会断裂。胶原的肽键一旦断裂,其螺旋结构随即被破坏,断裂的胶原多肽就被蛋白酶彻底水解。结缔组织细胞或炎症细胞能吞噬被胶原酶作用所得的大的片段，然后由溶酶体进一步降解为小分子多肤或氨基酸王娜.酶法提取猪皮胶原的工艺研究酶法提取猪皮胶原的工艺研究[D].四川大学硕士位论文，四川大学硕士位论文，200.生物学性质——

止血和修复与功能胶原具有止血性能，该性能的发挥通过两方面实现，即促进血小板凝聚和血浆结块。胶原可以与血小板通过粘合、聚集形成血栓起到止血作用。当血管壁的内皮细胞被剥离时，血管中的胶原纤维暴露于血液中，血液中的血小板立刻与胶原纤维吸附在一起，发生凝聚反应，生成纤维蛋白并形成血栓，进而血浆结块阻止血流。胶原的天然结构特别是其足够发达的四级结构，是胶原具有凝聚能力的基础。胶原是参与创伤愈合的主要结构蛋白[11]。胶原蛋白还可促进肉芽组织生成，加速创面的愈合。胶原分子对成纤维细胞的趋化反应，使胶原在伤口愈合过程中起重要作用。BaileyA.Collagennature'sframeworkinthemedical，foodandleatherindustry[J].JSocLeatherTechChem,1992,76(4):111-127.]郭爱华，柳大烈，赵嫚.胚胎无痕愈合的调控机制研究：（II）胎儿皮肤成纤维细胞体合成胶原的试验研究[J].中国临床康复，2002，6（2）：212-213.性质理化性质胶原蛋白质是一种两性电解质,这取决于两个因素,其一,胶原每个肽链具有许多酸性或碱性的侧基;其二,胶原每个肽链的两端有α-羧基和α-氨基,这些基团都具有接受或给予质子的能力,这些可解离的基团在特定的pH值范围内,解离产生正电荷或负电荷。胶原(牛皮)的等电点是7.5～7.8,呈现出偏碱性,因为胶原的肽链中碱性氨基酸比酸性氨基酸多一点。胶原是高分子化合物,在水溶液中具有胶体性质和一定粘度,粘度在等电点时最低,而且温度越低,粘度越大。分类胶原蛋白是一类蛋白质家族。现已至少发现了30余种胶原蛋白链的编码基因。可以形成16种以上的胶原蛋白分子。根据它们在体内的分布和功能特点,目前将胶原分成间质胶原、基底膜胶原和细胞外周胶原,间质型胶原蛋白分子占整个机体胶原的绝大部分。包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原蛋白分子,Ⅰ型胶原蛋白是在动物体中发现的一种结构蛋白,是胶原纤维组分中的一部分。它来源于表达在胶原蛋白α链上的COL1A1和COL1A2基因。Ⅱ型胶原蛋白由软骨细胞产生;基底膜胶原蛋白通常是指Ⅳ型胶原蛋白,其主要分布于基底膜;细胞外周胶原蛋白通常中指Ⅴ型胶原蛋白,在结缔组织中大量存在。羟脯氨酸是一种胶原蛋白特有的氨基酸,约占胶原蛋白的9%~13%。景沛.胶原蛋白质(Ⅰ-Ⅷ)[J].生命化学,1995,15(6):30-31.制备方法——来源胶原蛋白广泛的存在于动物的皮和骨骼中，如猪皮、牛筋、鱼、鸡的皮肤及骨骼中中也存在胶原蛋白。胶原蛋白的来源很多，但目前工业上生产主要来自牛、猪、鱼的皮肤骨骼等。但近年来由于疯牛病等流行病的发生，不少发达国家已经禁止使用从牛皮和牛骨中提取胶原蛋白王南平，郭鹏达等.鱼鳞胶原蛋白的研制[J].水产科技情报，2004，31(6):263-264.制备方法——来源猪体鱼体鸡体鹿骨羊骨制备方法——热水提取法热水提取法是将原料经过除杂蛋白等前处理之后，直接在热水中提取已经变性了的胶原蛋白或胶原蛋白水解物的方法，使用的温度有100℃沸水浴、60-70℃、40-42℃、45℃。钱曼等以草鱼鱼鳞为原料，在料液比1∶20（w/v），121℃条件下提取5min，最后胶原蛋白的提取率为45.57%。钱曼，武贤壮，邱承光，等.热力法和酶解法提取鱼鳞胶原蛋白的工艺及性质研究[J].食品工业科技，2007，10：70-72.制备方法——酸提取法酸提取法常用的酸有：甲酸、乙酸、盐酸、草酸、柠檬酸、乳酸等。低离子浓度酸可以破坏分子间盐键和希夫氏碱，引起胶原纤维膨胀、溶解。迪歌·弗兰用0.lmoL/L乙酸长时间浸泡皮块，皮中的未交联胶原可以溶解于醋酸中，通过冷冻干燥最后得到未变性胶原。使用酸提取胶原时，根据酸浓度、水解温度、水解时间等条件的不同，可以得到分子量不均的胶原水解物。但是在等浓度酸彻底水解过程中色氨酸会全部被破坏，丝氨酸和酪氨酸也会部分被破坏。因此，酸法溶出生物医用胶原要准确控制酸度、温度、时间等影响因素。迪歌·弗兰.胶原及其制备方法[P].CN:94104697.4.林炜，穆畅道，王坤余，等.皮革固体废弃物资源化Ⅱ-胶原的性质及其在医药和化妆品工业中的应用[J].中国皮革，2001，30（15）：8-11.制备方法——碱提取法碱提取通常使用氢氧化钠，碳酸钠等，碱性条件下提取胶原，易引起蛋白质变性，如胶原肽键水解，含羟基、疏基的氨基酸全部被破坏；所得产物等电点pH值较低，天冬酞胺和谷氨酞胺分别转变为天冬氨酸和谷氨酸；如果水解严重，则会产生D、L型氨基酸消旋混合物，若D型氨基酸含量高过L型氨基酸，则会抑制L-型氨基酸的吸收，有些D型氨基酸有毒，有的甚至有致癌、致畸和致突变的作用。因此，在提取结构完整、使用安全的胶原时，很少采用碱法提取胶原。李彦春，靳立强，危东发，等.酶法提取牛皮胶原蛋白的研究闭.中国皮革，2002，31(23):6-9.制备方法——酶提取法酶法提取是在预处理后的材料中加入酶制剂，溶解材料，再经过其他操作提取胶原蛋白。用蛋白酶处理猪皮，不仅可以水解掉胶原纤维蛋白的末端肽，提高胶原蛋白的产率；而且还不会破坏胶原蛋白的三股螺旋结构，保持其优良的物理和生化特性。通常使用的蛋白酶主要有中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶等。酶法水解提取胶原的影响因素主要有酶的用量、水解pH、水解时间、以及水解温度。酶法提取胶原的一般提取工艺为：预处理→酶解→盐析→透析→冷冻干燥。用酶解法提取胶原蛋白是目前比较理想的手段，它具有反应快、时间短、对环境友好，提取胶原蛋白纯度高、水溶性好、理化性质稳定等特点。叶易春，但卫华，曾睿，等.酶法提取牛腱胶原的研究[J].中国皮革，2005，34(7)：4-7.周文常，但卫华，廖隆理，等.猪皮胶原的提取及其结构表征[J].中国皮革，2004，33(13)：36-38.SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)——鉴别胶原蛋白及分析杂蛋白含量。SDS-PAGE消除了不同蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质按照分子量大小分离。通过与胶原蛋白标准品的电泳条带进行比较来鉴别胶原蛋白。SDS-PAGE首先，提取Ⅰ型胶原蛋白，分为3步,第1步：碾碎组织,使不溶解的Ⅰ型胶原蛋白沉淀离心出来。第2步：以胃蛋白酶消化切除尾肤共价键,使不溶解的Ⅰ型胶原蛋白呈可溶状态。第3步：用低浓度的抓化钠盐析夺取水化膜,中和胶原分子表面的电荷,使其相互聚集而沉淀析出最后的提取率大概在11%左右（相对总的Ⅰ型胶原蛋白）SDS——PAGE取提取的型胶原蛋白溶液,加人1/3体积的4*SDSLoadingbuffer,在沸水浴中变性5min,取出后离心（30s,4200r/min）,取上清分装，每管40µL。配置10mL6%的分离胶，8mL5%的积层胶，1mg/mL的标准Ⅰ型胶原蛋白。每孔中依次按顺序加入高分子量标准蛋白20µL,标准品及样品各40µL,接通电源,恒压电泳SDS——PAGE电泳结束后,卸下凝胶,剪8张大小相似的滤纸和一张PVDF膜先用甲醇浸泡PVDF膜,再将胶、滤纸、PVDF膜置于Transbuffer中(10min).打开转膜仪,由负到正,依次平铺4层滤纸、1层凝胶、1层PVDF膜及4层滤纸,压实、赶走气泡,打开转膜仪,按每平方厘米1mA,恒流转移3h.免疫杂交反应中,一抗为MonoclonalAnti-CollagenTypeⅠ,稀释度为1:1500,二抗为GoatAnti-MouseIgG-HRP,稀释度为1:2000SDS——PAGE把PVDF膜平放在干净的保鲜膜上,正面(蛋白质面)朝上,吸干膜表面的水份.加1mL显色液,室温显色2min左右,终止.在暗房中,