流式细胞术在临床及科研中的应用

流式细胞术在临床及科研

中的应用

中心实验室1一、流式细胞仪工作原理二、荧光染料选择三、样本制备四、数据分析处理五、流式技术生命科学中的应用2

流式细胞技术及工作原理在流动的状态中快速检测颗粒各种物理及生物特征的新型分析技术和分选技术；样品的液流技术细胞分选和计数数据采集和分析流式技术是综合高科技技术的结晶InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid3流式细胞术能做什么？

●检测悬浮的各类细胞或微粒

动、植物细胞，细菌，病毒遗传物质（DNA,RNA)、各种蛋白质或其他分子。还可以研究塑料微球或其他悬浮于液体中的微粒。

●区分“死”、“活”细胞

●鉴别“生物样本”、与“非生物样本”

●测定细胞或颗粒的散射光、染色荧光、自发荧光

●细胞分选4

5流式细胞仪原理检测信号散射光信号前向散射光信号(FSC)：与激光束方向同轴的称前向角散射光信号侧向散射光信号(SSC)：与激光束垂直的称为侧向角散色光信号荧光信号6流式细胞仪原理7流式细胞仪原理前向角散射光信号（FSC）FSC反映细胞大小，一般来说，细胞越大，前向角散射光信号越强；FSC信号与细胞的折射率有关；可用于表示细胞的凋亡；区分死/活细胞时，可用于设门8

流式细胞仪原理侧向角散射光信号（SSC）SSC信号主要反映了细胞的内部结构，内部结构越复杂，SSC信号越强；9流式细胞仪原理10流式细胞仪原理特征荧光信号当荧光抗体或标记其他染料染色的颗粒通过激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返回基态时，染料释放出能量，大部分以光的形式释放。这种发射出的光称为荧光。

11流式细胞仪原理激光光源波长:

488nmFITCPE,PE-CY5/PerCP635nmAPC12影响因素：三稳定一确保

荧光实验条件稳定

正压光电系统稳定液流系统稳定确保单细胞悬液分散均匀，无过量杂质混入13

样本制备14

样本制备可检测的样本种类多样

外周血，骨髓、穿刺液，洗脱液，培养细胞血清、血浆、培养上清、细胞裂解液实体组织等

15

样本制备细胞悬液制备

荧光标记

16

新鲜组织标本经胰酶消化制备单细胞悬液溶血

Ficoll梯度离心获得PBMC

细胞悬液浓度：106－107/ml

活细胞的存活率>90%肝、脾、淋巴节扁桃体等组织17荧光染料的选择18

荧光染料的选择每一种荧光染料有自己的激发波长和相应的发射波长选择荧光染料要考虑:流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料流式细胞仪配置的光学收集系统可否检测该荧光染料的发射波长同时使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰19

荧光染料的选择488nm激光激发的染料20

荧光染料的选择633nm激光激发的染料(APC)595nmand633nmEXCITEDDYES21

荧光染料的选择UV激光激发的染料22

荧光染料的选择常见荧光染料的发射波长23

荧光染料的选择荧光染料的选择不同的荧光素有不同的发射光强度；能否区分阳性与阴性，与选用何种荧光染料标记的抗体密切相关；高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光素（如PE和APC）标记的抗体检测；

荧光染料信号的“强弱”与所用的流式细胞仪也有关系，同一份样本在不同型号流式细胞上检测的结果会不同；这种差异主要是因为光学系统的不同；24

荧光染料的选择非特异结合有些荧光标记的抗体表现出低水平的非特异结合，会造成阴性细胞的荧光水平升高。有些染料如（Cy3、Cy5和Cy5.5）和TexasRed直接标记的抗体，以及某些复合染料如ECD，与某些细胞亚群的结合性增强。

2526数据分析27

数据分析数据显示：单参数直方图二维点图二维等高图假三维图及列表模式数据分析：检测指标阳性百分率（%）绝对计数（个/L

）平均荧光强度（MFI）2829

数据分析设门用来限定感兴趣的细胞群；FSCvsSSC点图是传统上用于设门的图；分析淋巴细胞群时，CD45vsSSC点图设门更优于FSCvsSSC点图设门；30

数据分析设门-确定要分析的目的细胞群SideScatterForwardScatter0200400600800100002004006008001000R131

数据分析设门100101102103104SSC-HeightR1CD3-PE100101102103104100101102103104Anti-HLA-DRFITCGatedonR1100101102103104CD25-PE32

数据分析对照样本

检测样本33

数据分析直方图统计表34

数据分析点图统计表对照样本检测样本35流式细胞技术进展

多激光，多色分析增加检测参数而不影响检测灵敏度，

新荧光染料的开发紫外光激发的PacificBlue，AlexaFluora405；蓝光激发的AlexaFluora488；红光激发的AlexaFluora647;

荧光耦连物，如PE-Cy5，APC-Cy7，PerCP-Cy5.5等电子系统数字化荧光间补偿的调整也更加简单,并可以脱机补偿。36流式细胞仪临床应用的新进展

多色分析：提高了流式细胞分析的信息量绝对计数：单平台绝对计数方法荧光定量分析：可以判断细胞上抗原表达密度，细胞荧光强度越强，细胞抗原表达密度也越高微生物分析：直接对微生物颗粒进行分析，快速灵敏，尤其适合生长缓慢的微生物，如分支杆菌，一些霉菌等37

荧光定量分析（QFC)判断细胞上抗原表达密度，细胞荧光强度越强，细胞抗原表达密度也越高荧光定量分析可以有效区分弱表达与强表达。荧光定量分析可以消除不同仪器检测检测误差，使不同仪器间的结果具有较好的可比性。在细胞的发育分化过程或疾病进程中，细胞某一抗原可能持续表达，但其表达密度随细胞变化而改变，这时就需要进行细胞的荧光定量分析了。

38流式细胞技术在生命科学中的应用细胞表面抗原分子的测定细胞凋亡检测细胞因子测定（胞内、胞外）在肿瘤学方面的应用在血液学方面应用细胞分选39淋巴细胞免疫分型T-细胞亚群（CD4/CD8/CD3）

早期活化T亚群（CD4/CD69/CD8）活化T淋巴细胞（CD3/HLA-DR）活化的T细胞亚群（CD4/CD25/CD8）调节性T细胞:D4+CD25+/CD8+CD25+B-淋巴细胞（CD3/CD19）

B-淋巴亚群（CD19/CD5）

NK—细胞（CD16/56)40淋巴细胞亚群分析临床意义-机体免疫状态的评价通过对机体免疫状态的检测可了解在不同情况下体内免疫功能状态,探索疾病的发病机理、跟踪病程、判断预后，监测、指导临床治疗方案。41淋巴细胞亚群分析临床意义感染性疾病病毒性肝炎乙肝感染后,一方面通过体液免疫阻止病毒感染,减少病毒载量,另一方面细胞毒性T淋巴细胞在清除病毒和肝细胞破坏上起了双重的作用。一般CD8+百分比比增高。监测治疗：病毒的清理主要通过细胞因子,尤其是TNF和IFN.这一过程对肝细胞并不造成损害.判断预后：病人的预后有赖于病毒载量和机体免疫状态之间的平衡。42淋巴细胞亚群分析临床意义感染性疾病ADIST淋巴细胞总数减少

T细胞亚群（CD3+CD4+/CD3+CD8+）比例倒置，Th/Ts<1.0Th细胞(CD4+细胞)绝对计数<200个/lTs细胞增高

NK细胞减少或活力下降

B细胞正常43淋巴细胞亚群分析CD4+CD4+正常人爱滋病人44淋巴细胞亚群分析临床意义免疫缺陷性疾病先天性胸腺发育不全，也称DiGeorge综合征，又称伴有甲状旁腺功能低下的免疫缺陷。淋巴细胞计数通常较低。自身免疫性疾病SLE病人：CD8+淋巴细胞百分比降低胰岛素依赖性糖尿病：CD8+淋巴细胞百分比增高类风湿性关节炎：CD4+/CD8+比例增高45淋巴细胞亚群分析临床意义肿瘤肿瘤患者免疫功能检测肿瘤化疗的监测个体对肿瘤化疗的承受力免疫治疗的监测46骨髓移植和器官移植移植前检测受者血清中抗供者的anti-HLA抗体监测骨髓中的肿瘤细胞或造血干细胞移植后监测移植期间受者的免疫状况47抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)抗原特异性细胞毒性T细胞（CTL）主要为CD8+T细胞，少数为CD4+T细胞。是MHC-Ⅰ类分子限制性T细胞。TCR识别抗原肽-MHCⅠ类分子复合体（靶细胞）且具有杀伤活性，故称为细胞毒性T细胞。定量分析抗原特异性CTL细胞为阐明疾病免疫应答的自然发生过程，分析疾病的转归发挥重要作用。主要应用于抗感染免疫，移植物免疫，肿瘤免疫。48HLA-B27鉴别骨关节疾病，是诊断强直性脊柱炎等疾病的有效指标强直性脊柱炎、Riter氏病、急性前葡萄膜炎HLA-B27检测系统49HLA-B27HLA-B27阴性样本HLA-B27阳性样本50细胞活化及细胞因子的检测免疫调控病因研究：AIDS、肿瘤、自身免疫疾病T淋巴细胞亚群对病原体的反应能力机会感染时的细胞反应药物/疫苗疗效评估化疗时免疫状况评估免疫状况监测：移植、寄生虫病、毒理、营养、外伤51细胞因子与Th1/Th2细胞Ⅰ型细胞介导免疫反应引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2型反应下调刺激来源：病毒、某些细菌Ⅱ型体液介导免疫反应引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1型反应下调刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源52DNA细胞周期分析

肿瘤早期诊断/鉴别诊断（交界性肿瘤、良恶性判别）、复发转移、预后评估、肿瘤治疗肿瘤细胞增殖周期肿瘤细胞表面标记、癌基因表达产物多药耐药性凋亡53DNA细胞周期分析细胞周期G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNA分析DNA含量细胞数量2N4N

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DNA细胞周期分析参数DNA倍体性Ploidy：细胞内染色体DNA含量二倍体Diploid：正常体细胞内染色体DNA含量DNA指数（DI）：测定标本的G0/G1期细胞DNA含量与同种系正常细胞的G0/G1期细胞DNA含量的比值，表示细胞倍体性S期含量SPF：S期细胞占总周期细胞的比例增殖指数PI：增殖细胞占总周期细胞的比例G0/G1期细胞DNA含量变异系数CV55DNA分析的临床意义DNA分析诊断肿瘤DNA非整倍体细胞峰突出的四倍体细胞峰SPF>10-15%DNA倍体分析： 结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析： 反映了肿瘤的生长速度和侵袭性56

组织标本准备新鲜组织标本：机械法或胰酶消化制备单细胞悬液冰冻组织标本：组织复苏机械法制备单细胞悬液石蜡组织标本：脱腊：二甲苯浸泡石蜡组织切片脱石蜡（1－2天）水化：梯度酒精到蒸馏水组织逐步水化

（每步10min)

消化：胃蛋白酶解聚分散组织细胞间的蛋白物质

（370C，30分钟）

过滤收集细胞：300目筛网57

细胞凋亡检测流式细胞