结核分枝杆菌和耐药基因的特征

..系统细菌学课程论文题目：结核分枝杆菌及其耐药基因的特征专业：生物工程姓名：魏文凭学号：中国·XX二0一六年十二月结核分枝杆菌及其耐药基因的特征摘要：分枝杆菌属主要包括结核分枝杆菌复合群〔包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、麻风分枝杆菌和非结核分枝杆菌。造成人畜共患病的结核分枝杆菌和引起麻风病的麻风分枝杆菌是威胁人类健康的两类病原菌,而非结核分枝杆菌病疫情也逐年增加。因此关注分枝杆菌具有重要的科学意义及应用价值,对农业、卫生和环境都用深远影响。本文主要介绍分枝杆菌的特征和一些耐药基因的研究。关键词：耐药机制结核病生物学特征结核病的认识及治疗发展结核分枝杆菌〔Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis是全球第二大致死性传染病—结核病的病原体。结核分枝杆菌最大的特点就是持留性〔persistence[1],有时感染可达几十年,因此全球约有三分之一的人口感染结核分枝杆菌,其中每年死于结核病的人数高达180万〔WorldHealthOrganization.2016。中国是结核病高发的国家,已被世界卫生组织列为全球22个结核病高负担和特别警示的高耐药国家之一。结核病很早就存在,在考古学界,从新石器时代人遗骨中发现有骨结核,古埃及木乃伊中也发现有结核病,说明结核病的历史可追溯到公元前2400-3400年。在中国历史上,结核病也是广泛流行的,当时称为痨病,是一种慢性呼吸道疾病,在认识到它的致病菌之前,人们没有治疗的手段,只能通过环境的影响,在空气清新、气候湿润的地域抑制结核病的发作。在1882年,德国微生物学家罗伯特·科赫〔RobertKoch通过特殊的染色技术,发现了细棒状的结核杆菌,又通过血清培养基获得了结核杆菌,证实了结核杆菌是结核病的病原菌。自此对结核病有了清晰的认识,对于结核病的检测技术也不断发展。法国科学家卡尔梅特〔Calmette和格林〔Guerin在1908年和1919年间,经过230次的传代,获得了一株牛分枝杆菌减毒株,卡介苗[2]。自1921年首次使用以来,成为有效治疗儿童结核病的疫苗,但对于成人型结核病的的治疗很有限。到了上世纪中期以来,临床上又应用了一些抗结核的药物,如异烟肼〔INH、利福平〔RIF、链霉素〔SM、吡嗪酰胺〔PZA等,使得结核病的防治得到了有效控制。但到了90年代,耐多药菌和广泛耐药菌的发现,以及世人对结核病防治的放松导致该病大有席卷重来之势。因此对结核分枝杆菌疗效确切、治疗周期短、安全性高的疫苗的研发迫在眉睫。2、结核分枝杆菌的特点2.1细胞结构特点结核分枝杆菌是一种胞内菌,属于放线菌,传统革兰氏染色效果不明显,因为其细胞壁含有分枝菌酸,抗酸性染色为阳性。分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌,大小为1-4×0.4μm,无鞭毛,无芽孢,不能产生内外毒素,需要特殊的培养基进行培养,生长极度缓慢,菌体成分为糖类、脂质、蛋白质等。科学工作者研究一般选择耻垢分枝杆菌,它是分枝杆菌的模式生物,具有快速生长无致病性的优点[3]。分枝杆菌具有大量的脂质,占菌体重量的20%—40%,胞壁中含量最多。几乎没有其他生物能像结核杆菌这样产生如此多的脂溶性分子,多项研究表明细菌的毒力与其所含的脂质分子有关,尤其是糖类[3]。脂质可防止菌体水分丢失,因此结核杆菌对干燥的抵抗力特别强。对酸〔3%HCl或6%H2SO4或碱〔4%NaOH有抵抗力,15min内不受影响。对多种抗生素敏感,但长期使用易引起耐药性,而且耐药基因能够遗传。结核分枝杆菌能侵染机体的任何组织、器官,其生长极度好氧,肺部感染是最主要的致病方式,目前研究发现其毒力因子很多,包括索状因子、脂阿拉伯甘露聚糖、分泌蛋白、代谢相关因子、转录因子、双组份调节系统、分泌系统和应激蛋白等[4]。从分子生物学角度来看,对毒力基因的了解知之甚少。研究较多的是：编码毒素-抗毒素系统的基因,控制细胞的程序性死亡以应对环境压力[5]。编码sigma因子的基因,通过与whiB3相互作用而活化相关基因的表达[6]。编码过氧化氢酶的基因应对低氧胁迫及对抗宿主巨噬细胞的活性氧[7]。Lam,KatG对细菌在巨噬细胞中的生存起作用[8]。2.2基因组和比较基因组特点M.tuberculosisH37Rv全基因序列图于1998年由英国和法国科学家联合完成,20XX临床分离株CDC1551的全基因组测序完成,标志着分枝杆菌的研究进入到后基因组时代。对基因组的注释及分析成为当务之急,近些年来,全球组学的研究取得了巨大进展,为分枝杆菌的诊断、进化、靶标提供了良好的基础。H37Rv全基因组由4411529bp组成,包括4000多个基因,已发现4005个ORFs[9]。其基因组有几个重要的特征,G+C含量相对稳定,高达65.6%；起始密码子中有35%是GTG,远远高于枯草杆菌的9%和大肠杆菌的14%,这造成结核菌高G+C偏向；有明确功能的基因大概有2441个,不含插入序列的假基因有6个,仍有600多个基因不知其功能[10]。值得注意的是其有相当多的基因编码参与到脂肪代谢的酶类中,有10%的基因编码PE和PPE蛋白家族,这是分枝杆菌特有的重复序列基因,而其功能仍未知,不过根据已有的研究表明,它们在免疫学方面有重要作用[9]。近年来,有人通过芯片技术来比较不同分枝杆菌菌株的基因组差异。在无毒性的耻垢分枝杆菌中,mutY和mutM在维持耻垢非致病性起作用,另外耻垢通过半胱氨酸天冬酰胺酶依赖途径来诱导宿主细胞凋亡,相比结核杆菌,非致病菌能诱导机体产生更强的天然免疫应答[11]。在结核分枝杆菌特有的129个开放阅读框中〔ORF,指出有39个ORF在卡介苗BCG中缺失〔主要存在3个RD区域,29个在部分BCG菌株中缺失[3]。这些H37Rv特有的ORF在无毒株中缺失,表明这些基因可能是代表了毒性因子编码基因,也可能是结核分枝杆菌保护性抗原编码基因[12]。3、结核分枝杆菌的致病机理结核分枝杆菌在长期的宿主-细菌相互作用过程中,形成了自身独特的生活习性,使其能够适应宿主的免疫系统[13]。在感染宿主后机体会调动自身免疫防御系统来抵御外来入侵者,巨噬细胞在其中起重要作用。巨噬细胞是人体抵御外界压力的第一道天然免疫屏障,在巨噬细胞感染后会利用吞噬溶酶体来降解细菌,并和树突状细胞一起引起宿主的一系列信号传导导致感染的细胞死亡[14]。结核分枝杆菌通过调控相关蛋白的表达使其能够在宿主中存活几十年,和宿主达到一种平衡[15]。在成熟的吞噬溶酶体内,会由细胞氧化酶和诱导性氮氧化物合酶生成大量的活性氧,从而杀死病原菌。而分枝杆菌则通过分泌GroEL2蛋白与巨噬细胞发生相互作用,影响巨噬细胞的识别与吸附[16]。通过也会阻止吞噬溶酶体的形成和酸化,抑制自噬的形成,从而维持分枝杆菌的蛋白活性[17]。分枝杆菌在低氧的环境中会进行休眠,并合成大量的交叉连结肽聚糖维持自身的生存,PhoP等双组份调控系统对于应对低氧胁迫有重要作用[18]。DosR蛋白与分枝杆菌的潜伏感染息息相关,DosR能调控约50个快速响应的基因,起到应对低氧环境紧急措施的目的；在低氧处理一段时间后,受到调节的基因达到几百个。显然这些持久性低氧胁迫基因与结核分枝杆菌的潜伏持留感染有关[19]。4、结核分枝杆菌中的耐药基因结核分枝杆菌在抗结核药物研发出来时,有很好的治疗效果,但由于结核杆菌耐药机制的形成,造成药物的长期使用疗效急速下降。而目前结核杆菌的耐药机制仍未完全了解清楚。近几十年的研究表明药物作用的靶标的改变是大部分结核杆菌产生耐药的主要原因,但也包括细菌的药物外排泵机制、细胞膜通透性的改变等[20,21]。结核杆菌耐INH的原因很多,涉及到katG、NADH脱氢酶基因ndh、烯酰基载体蛋白还原酶基因ihhA、酮酰基酰基转移蛋白酶基因kasA以及烷基过氧化氢酶基因ahpC等。其中主要的是katG的突变,katG编码过氧化氢-过氧化物酶,该酶能将INH氧化成异烟酸,成为烟酸的类似物,从而抑制细胞壁枝菌酸的合成[22,23]。利福平的作用是通过与结核杆菌RNA聚合酶的β亚单位结合,干扰转录的开始和RNA的延伸。若β亚单位突变,则阻止利福平的结合,造成耐药；而细胞壁结构的改变则会导致药物的摄入减少,这种情况在鸟分枝杆菌复合群中有发现；因此两种可能都不能排除[24]。链霉素是第一种有效的抗结合药物,目前在没有新药出现的情况下仍是结核病治疗的一线药物。它是一种氨基环醇糖苷类抗生素,通过干扰蛋白质的合成而发挥作用。编码核糖体蛋白S12基因和16SrRNA基因的突变是目前认为耐SM的的原因,但具体机制不完全清楚[21]。吡嗪酰胺是一种烟酰胺类似物,PZA渗透入吞噬细胞后并进入结核杆菌菌体内,菌体内的酰胺酶使其脱去酰胺基,转化为吡嗪酸而发挥抗菌作用。pncA基因突变导致吡嗪酰胺酶活性下降或丧失,严重影响酶的功能。在耐PZA的一部分分离株中,发现pncA基因并未突变,说明还有其他的耐药机制[25]。5、小结耐多药菌和广泛耐药菌的出现以及未有新的抗结核药上市的情况下,人类正面临着结核分枝杆菌的严重威胁,对抗结核药物的新靶点的发现、全新抗结核药物机制的筛选,以及结核治疗靶向给药系统等的研究将为人类有效控制结核病奠定了基础。参考文献1.赵宇中,谢建平.全球分枝杆菌组学研究十年纵览:以结核分枝杆菌为例[J].微生物学通报,2013,40<10>:1929-1948.2.李洱花,梁张,宝福凯,柳爱华.结核新疫苗研究进展[J].中国病原生物学杂志,2015,10<1>:69-74.3.李兴芳.结核分枝杆菌的生物学特性与致病机制研究[J].XX医药,2010,29<5>:496-499.4.董海燕,张建中,万康林.结核分枝杆菌毒力相关因子研究进展[J].医学研究杂志,2011,40<6>:157-160.5.M.Yang,C.Gao,Y.Wang,H.ZhangandZ.G.He,Characterizationoftheinteractionandcross-regulationofthreemycobacteriumtuberculosisrelbemodules,PloSone5<2010>,no.5,e10672.6.R.Manganelli,R.Provvedi,S.Rodrigue,J.Beaucher,L.GaudreauandI.Smith,Sigmafactorsandglobalgeneregulationinmycobacteriumtuberculosis,JournalofBacteriology186<2004>,no.4,895-902.7.Y.LiandZ.G.He,Themycobacteriallysr-typeregulatoroxysrespondstooxidativestressandnegativelyregulatesexpressionofthecatalase-peroxidasegene,PloSone7<2012>,no.1,e30186.8.S.T.Tseng,C.H.Tai,C.R.Li,C.F.LinandZ.Y.Shi,Themutationsofkatgandinhagenesofisoniazid-resistantmycobacteriumtuberculosisisolatesintaiwan,JournalofMicrobiologyImmunology&Infection48<2015>,no.3,249-255.9.宛宝山,张秋芬,周爱萍,等.结核分枝杆菌基因组学与基因组进化[J].生物化学与生物物理进展,2012,39<7>:7-16.10.ZhangJ,ZhangY,JiC,etal.AsurveyofMycobacteriumomicsstudiesoveradecade:M.tuberculosisasacasestudy[J].MicrobiologyChina,2013,40<10>:1929-1948.11.侯晓青,刘丹,王易.耻垢分枝杆菌在感染与免疫研究中的应用[J].微生物与感染,2014<4>:238-244.12.S.T.Cole,Learningfromthegenomesequenceofmycobacteriumtuberculosish37rv,FEBSLetters452<1999>,no.1-2,7-10.13.A.D.TischlerandJ.D.Mckinney,Contrastingpersistencestrategiesinsalmonellaandmycobacterium,CurrentOpinioninMicrobiology13<2010>,no.1,93-99.14.S.Buroni,M.R.Pasca,R.S.Flannagan,S.Bazzini,A.Milano,I.Bertani,V.Venturi,M.A.ValvanoandG.Riccardi,Assessmentofthreeresistance-nodulation-celldivisiondrugeffluxtransportersofburkholderiacenocepaciainintrinsicantibioticresistance,BMCMicrobiology9<2009>,no.1,1-11.15.李瑞芳,管志玉,付玉荣,等.结核分枝杆菌与宿主作用相关蛋白研究进展[J].中国人兽共患病学报,2014,30<3>:306-309.16.C.H.Gao,M.YangandZ.G.He,Characterizationofanovelarsr-likeregulatorencodedbyrv2034inmycobacteriumtuberculosis,PloSone7<2012>,no.4,e36255.17.苗青,申阿东.结核分枝杆菌与宿主巨噬细胞相互作用机制的研究进展[J].XX医科大学学报,2010,41<10>:920-924.18.邬博,雷英