鸡胚培养和细胞培养

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第一节

鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非SPF鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用SPF鸡胚。一般说来，孵育至8-14天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒，14天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。孵育至21天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为尿囊膜，系内胚层形成，两膜所夹为中胚层。由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。 尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液，以后则尿酸盐含量增高。尿囊液量在11-13日龄时最高，平均达6毫升左右。羊膜是胚胎的最内层包被，系外胚层和中胚层形成，羊膜腔内含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水溶液，以后蛋白质含量增加。羊水量在8-15日龄时最高，平均约为1毫升左右。附着于胚胎上的是卵黄囊，其膜系由内胚层和中胚层形成，内包卵黄，是胚胎发育的养料。卵的尖端（俗称“小头”）是卵白，是胚胎发育晚期的养料二、 鸡胚培养实验用器械不鸡胚培养技术简便，但一些最基本的设备仍需具备，它们包括：孵化箱、检卵器、卵架、打孔器、镊子、酒精灯、无菌眼科镊子和剪刀、吸头、洗耳球、注射器、适用的针头、无菌试营、平皿、三角瓶、烧杯、消毒胶布、石蜡和灭菌生理盐水等。下面就一些最基本的设备作一简单介绍：孵化箱是给受精卵提供发育条件的设备，要求恒温恒湿。市售专用孵化箱可自动进行气体交换和翻蛋。实验室中，常用普通恒温培养箱或恒温室代替，要注意保持室内湿度和人工翻蛋。检卵器有市售专用检卵器，在暗室中操作。也可根据条件向行设计，用木板制成一大小为35X25.5X15厘米的木盒，上半层为一暗室，上方开一小孔，以便于用眼检视鸡胚，两侧开大孔以供双手伸入小暗室转动鸡胚蛋和进行标记。木盒中间有一隔板，其中间部位开一卵形圆孔，木盒下层安装有 100瓦灯泡，待检胚蛋置于卵形孔上。开灯检查，不必在暗室中进行。打孔器可用剪刀代替.卵架孵育用盛放鸡胚蛋的卵盘有市售专用者，实验操作中所用卵架可用木板制成小方盒，上面开一卵形孔。三、 鸡胚的实验室孵育选择实验室用鸡卵，最好用白色薄壳鸡蛋，其易于观察胚胎的生活情况。实验用卵一般不宜保存过长时间，通常保存期不应超过 10天，5天以内最好。而且不宜在高温下保存，通常保存于4~20C以10C条件下最好。适宜的孵育温度为38~39C，相对湿度为45~60%，并注意空气流通。孵育3天后每天应翻卵1~2次，以保证气体交换均匀，发育齐全，从而避免半边发育现象的出现。孵后第四天用检卵器对鸡卵进行检视，检出未受精卵和死亡的鸡胚。经四天孵育后，未受精卵不见有鸡胚迹象，仅见模糊的卵黄暗影；受精卵则可见清晰的血管小团，其中有鸡胚迹象，较大的鸡胚可见到胚胎主动运动；濒死或死亡的鸡胚则见到胚胎运动呆滞或不运动，血管昏暗、折断或漂落，这种鸡胚应剔出不用。四、鸡胚的接种绒毛尿囊膜接种主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖，这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑和病斑。此外其它用于绒毛尿囊腔接种的病毒也可使用，而且收毒量更高，缺点是操作不易成功。选取10-13日龄的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出，并在胚位附近无大血管处，划一记号，用蛋钻在卵壳上磨一裂缝（或用电烙器在卵壳上烙出一个直径为2-3mm的烤焦圈），小心将蛋壳去掉，注意切勿损伤壳膜；在气室中央也钻一个小口，用针尖挑破壳膜，切勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加1滴无菌生理盐水于刺破处，用吸耳球紧贴气室中央小口，造成负压，即可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜凹下，和壳膜分开，造成人工气室。滴加0.05-0.1ml接种物于绒毛尿囊膜上，腊封口，封口部位朝上，不要翻动， 37c培养。尿囊腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒，例如禽流感病毒和新城疫病毒的分离和增殖，马脑炎病毒也常用、旧D、IBDV也可。选取9-11日龄的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出，在气室边缘上打一小口，避开大血管处，注射器沿小口插入1-1.5cm，注入接种物0.1-0.2ml，腊封口。卵黄囊接种主要用于虫媒批膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体的分离和增殖。选取6-8日龄的鸡胚，照检后，将气室及胚胎位划出；垂直放置在卵座上，在气室中央钻一个小口，注射器沿小口插入3cm,注入接种物0.1-0.5ml，腊封口。羊膜腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖，操作技术比较困难。开窗法：从气室处去蛋壳开窗，从窗口用小镊子剥开蛋膜，一手用平头镊子夹住羊膜腔向上提，另一手注射0.05-0.1ml接种物于腔内，使蛋直立孵化，此法可靠，但胚胎易受伤而死，而且易污染。盲刺法：将鸡胚放在灯光向上照射的蛋座上，使蛋转动使胚胎面向术者。在气室顶部到边缘的一半处打一孔，用40mn长的针头垂直插入，月深30mm以上。如已刺如羊膜腔，能使针头拨动胚即可注入接种物0.1-0.2ml，如针头左右移动时胚胎随着移动，则针头已刺入胚胎，这时应将针头稍提起后再注射，石蜡封口。五.鸡胚材料的收获原则上接种什么部位，收获什么部位。（1） 绒毛尿囊膜：用碘酊、酒精消毒接种部位及四周，揭去封闭处的卵壳。用灭菌镊子扩大开口处，轻轻夹起绒毛尿囊膜，用消毒剪刀剪下接种面及周围的膜，置于灭菌生理盐水的平皿中。（2） 尿囊腔接种：收获前将鸡胚置4°c冰箱中6h或过夜将鸡胚冻死而使血液凝固，以免收获时流血。用碘酊、酒精消毒气室部位卵壳，以无菌镊子击破气室端卵壳，沿气室周围剪去卵壳，撕去壳膜和绒毛尿囊膜，用镊子轻轻压住胚胎，以无菌吸管或注射器吸取尿囊液于灭菌试管内。收集的液体应清亮，浑浊则表明有细菌污染；呈血红色，说明血管破裂；黄色液体，可能卵黄囊被刺破。应做无菌检验。（3） 羊膜腔：首先收取尿囊液，方法同上。后用注射器插入羊膜腔内收集，约可收到1ml液体，无菌检测。（4） 卵黄囊：先首先收取尿囊液和羊膜腔液，后用吸管吸卵黄液。将整个内容物倾入无菌平皿中，剪取卵黄膜保存。第四节细胞培养常用设备准备室的设备：单蒸憎水蒸憎器、双蒸憎水蒸憎器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80°C）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4C冰箱（放置serum和培养用液）。无菌操作无菌室的灭菌：定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3%。来苏尔或者新洁尔灭或者0.5%过氧乙酸擦拭。CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3%。新洁尔灭擦拭，然后用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸，再用紫外灯照射实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟实验后灭菌：用75%酒精（3%新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。实验人员的无菌准备：肥皂洗手。可减少手上的微生物。穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋。但是在洁净工作台上时就无需上述防护。如果你有长头发，则应把它系在脑后。不要说话或少说话。如果感冒，则最好不要做组织培养工作。用75%酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示：凡是带入超净工作台内的酒精、PBS培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精灯火焰操作。器皿使用前必须过火灭菌继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。器械的清洗和消毒一、新的玻璃器皿的洗消：自来水刷洗，除去灰尘。烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml:蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。高压消毒后烘干二、旧的玻璃器皿的洗消：1.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75%酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。橡胶和塑料：橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：1.针式滤器帽不能泡酸液，用NaOHfi6-12小时，或者煮沸20分钟，在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上（凹向上），然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。胶帽，离心管帽烘干后只能在2%氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。胶头可用75%酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。塑料培养瓶，培养板，冻存管：其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用 70%酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻（CoC126H2o）2g,30%盐酸10m1,蒸馏水88m1。注意事项：严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂：干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素.纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。具体步骤：水的制备：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水二PBS的制备与消毒（也可用于其它BSS女口：Hanks,D-Hanks液的配制）:溶解定容：将药品（NaCI8.0g,KCl0.2g,Na2HPO4H2O1.56g,KH2PO40.2g）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。胰蛋白酶溶液的配制与消毒：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37C时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS女口：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25%，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4°C内过夜。用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20C保存以备使用。青、链霉素溶液的配制于消毒所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克？RPMI1640的制备与消毒：溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中，并用双蒸水冲洗包装袋2-3次（冲洗液一并加入培养基中），充分搅拌至粉剂全部溶解并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml,使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4C冰箱内待用。使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4C时两周有效）六・血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56C水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。HEPES溶液：HEPES勺化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N'-a-hydroxythylpiperazine-N'-ethanesulfanicacid）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 pH范围。使用终浓度为 10-50mmol/L,一般培养液内含20mmol/LHEPES口可达到缓冲能力。1mol/LHEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS238.3g,加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4C保存。注意：因为现在市售HEPE为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES勺终浓度仍然为20mmol/L。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定， 4°C下放置1周可分解50%，故应单独配制，置于-20C冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4C冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为14mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20C保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。肝素溶液的配制：含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为-C。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。十J型胶原酶：0.1%1型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为1型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20C保存。十一.明胶溶液：因为明胶难于过滤，所以配制0.1%明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）一即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入 50ml小瓶中，4C保存。其他培养用液的配制：20ug/ml内皮生长因子，注意事项：配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2,可在配制时调PH至7.4。细胞传代培养（消化法）具体操作：传代前准备：预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、 PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热。用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。点燃酒精灯：注意火焰不能太小。准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。胰蛋白酶消化；加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS青洗湃洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37CO 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。吹打分散细胞：吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。分装稀释细胞：分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5X105/ml。最后要做好标记。继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为+十，占75%时为++十。传代细胞培养注意事项：严格的无菌操作适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。附：EDTA（0.02%乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：EDTA0.20g,NaCl8.00g,KCl0.20g,KH2PO40.02g,葡萄糖2.00g,0.5%酚红4ml,加入蒸馏水定容至1000mlo10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁.细胞的复苏细胞复苏的原则-快速融化：必须将冻存在-196C液氮中的细胞快速融化至37C，使细胞夕卜冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶， 对细胞造成损害。具体操作一.实验前准备：将水浴锅预热至37r用75%酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。二・取出冻存管：根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。迅速解冻：迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min离心3min制备细胞悬液：吸弃上清液。向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。细胞计数：细胞浓度以5X105/ml为宜。培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入 37C和5%C02的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。初学者易犯错误：1水浴锅未预热或者未预热到37r。水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。细胞计数实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。具体操作：一.准备工作：取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。细胞悬液制备：细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。细胞计数：盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4%）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。计算原细胞悬液的细胞数：按照下面公式计算细胞密度：（细胞悬液的细胞数）/ml= （四个大格子细胞数/4）x2X104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：四.细胞计数要点：进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。初学者易犯的错误：计数前未将待测悬液吹打均匀。滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。本实验特殊试剂的配制：4%台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤纸过滤，4°C保存。使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4%即可。细胞的冻存先将冻存管放入4C冰箱，约40min。接着置于-20C冰箱，约30-60min。置于-80超低温冰箱中放置过夜。置于液氮罐中长期保存。5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录注意事项：使用DMSOU，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下， DMS对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。不宜将冻存细胞放置在0C-60C这一温度范围内过以，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。鸡胚原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞的制作）取9-11日龄的鸡胚，将胚蛋气管端向上，用碘酊、酒精消毒气室，以镊子击碎卵壳并弃之，沿气室周围剪去卵壳，撕去壳膜和绒毛尿囊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，以Hanks液冲洗体表数次，移入灭菌小瓶中，在用剪刀剪成小块，使其成为约1mm3t小的碎块，以Hanks液冲洗体表数次；自水浴中取出预热的0.25%胰酶适量，一个鸡胚约需5ml胰酶，37C水浴消化15-20分钟，其间每5分钟轻摇一次，至液体变得混而稍稠，此时再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下降时则终止消化，吸弃胰酶，再以Hanks液冲洗三次，经大口吸管吹打分散，以少许营养液（DME培养液、10%卖牛血清、青链霉素500U/ml，PH7.2-7.4）轻轻悬浮，经8层纱布过率，收集的细胞经计数调整细胞浓度至106个/ml，混匀，分装于细胞培养瓶中，于CO2培养箱中37C培养24h-48h。长成单层的细胞换液，加入维持液：DME培养液、5%卖牛血清、青链霉素500U/ml，PH7.2第三章电子显微镜技术观察病毒（2学时）教学目的：熟悉掌握病毒的电子显微镜观察技术。教学重点：样品的基本制备技术。教学难点：病毒电镜样品的制备。基本教学内容：第一节电子显微镜技术概述电子显微镜的发展光学显微镜发明后，即成为医学、生物学和其他学科不可缺少的研究工具。可以看到许多微生物和构成生物的基本单元一细胞。但随着人类认识的逐步深化，对观察微小物体的要求越来越高。大型电子显微镜20~100万倍0.144~0.34nm中型电子显微镜5~20万倍0.34~1.0nm小型电子显微镜5万倍以下1.0nm以上电子显微镜的分类透射电子显微镜2扫描电子显微镜其主要特点是景深大，图像富有立体感，制样简便，在观察形貌的同时，还可以利用样品发出的其他信息在微小区域上作成份分析和晶体结构分析。第二节电镜样品的基本制备技术一.超薄切片超薄切片法是研究病毒特征以及病毒与细胞之间相互作用的有效手段。将组织或细胞样品，加入2.5%PH7.2戊二醛进行前固定，4C24小时；用PH7.2PBS中洗三次，每次10分钟；用2%四氧化饿在通风橱内进行后固定1.5-2小时；用PH7.2PBS?中洗三次，每次10分钟；分别用浓度为50%、70%、80%、90%、100%的乙醇进行脱水，每次10-15分钟，100%乙醇中脱水三次，其它浓度中各一次；用1：1的100%乙醇和丙酮、纯丙酮各置换一次，每次10分钟；用纯丙酮和环氧树脂包埋剂按浓度梯度对样品进行浸透；将样品置于恒温培养箱中聚合；用ULTRACDTB超薄切片机进行切片，将切片用载网捞起，放入培养皿中；用醛酸双氧铂、柠檬酸铅分别对样品染色15-20分钟，双蒸水中洗干燥后放入培养皿中待检。二.负染色负染色也叫阴性反差染色。这种染色法是用重金属盐类溶液与样品混合而使样品呈现出良好的反差。经这种方法染色的生物样品，在电镜下是暗背景下的亮物体像，与通常的染色性质相反，所以称之为负染色。分辨力高，可以看到病毒的亚单位结构；在较段时间内可得负染色的主要特点是反差强，分辨力高，可以看到病毒的亚单位结构；在较段时间内可得出结果。磷钥酸、醋酸铀等。最常用的是：PH6.8磷钥酸、醋酸铀等。最常用的是：PH6.8的2%被观察的材料最好是比较纯净的病毒悬液。磷鸨酸溶液适用于多种病毒。被观察的材料最好是比较纯净的病毒悬液。扫描电镜样品的制备扫描电镜具有分辨率高和景深长等特点，因此图像层次丰富，立体感强，能够显示细胞和组织的三维结构形貌，广泛应用于生物样品表面及其断面微结构的观察.免疫电镜免疫电镜技术是把免疫化学技术与电镜技术有机地结合起来，使之兼有两方面的特性,所以是研究抗原-抗体相互作用的一种方法.抗原-抗体之间的相互作用是免疫化学反应的基础，它具有高度的特异性，结合电镜的高分辨能力和放大本领，可在超微结构和分子水平研究各种组织和细胞内的免疫反应，并能精确定性、定位和半定量，使形态与机能紧密结合。第四章病毒和病毒成分的提纯（2学时）教学目的：熟悉掌握病毒和病毒成分的提纯。教学重点：病毒提纯的具体操作方法。教学难点：超速离心法提纯病毒的原理和方法。基本教学内容：第一节病毒的提纯病毒的提纯，就是应用各种物理、化学方法，以不使病毒受损伤和失活为前提，去除宿主细胞组分等非病毒杂质，提取出高纯度浓度的病毒样品。病毒的纯度只是一个相对的概念，通常以下列几点作为判定依据（1）物理均一性（2） 病毒滴度与蛋白质含量的比例（3） 免疫学反应（4） 结晶形成一-沉淀法中性盐沉淀法病毒一般在45%以上饱和度的硫酸铵溶液中沉淀，保持其感染性。聚乙二醇沉淀法聚乙二醇（PEG为水溶性非离子型聚合物，具有各种不同的分子量，用于病毒沉淀的主要是分子量为2000~6000的PEG将PEG配置成50流右的溶液，或直接将固体PEG加于病毒悬液中，使其达到所需浓度，通常在 4c搅拌过夜，然后离心使病毒沉淀。3有机溶剂沉淀法4等电点沉淀法二.层析法葡聚糖柱层析法凝胶层析法离子交换纤维素柱层析法亲和层析法.红细胞吸附法所谓病毒的红细胞凝集反应，就是指病毒被红细胞表面粘蛋白吸附的现象。电泳法超速离心法病毒经初步浓缩之后，要进一步纯化，通常采用超速离心法差速离心法差速离心法适用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或经过红细胞吸附-释放的病毒悬液中提纯病毒。以差速离心法分离提纯病毒时，经常以低速（2000~3000rpm，20-30分钟）及中速（10000rpm，20-30分钟）去除较大的宿主细胞碎片、污染的细菌及其他较大的杂质。然后，选择在60分钟内能够沉淀80%以上的病毒粒子的较高速度，离心1-2小时，使病毒沉淀。对中、大型病毒如流行性感冒病毒，在经红细胞吸附一稀释后，于25000rpm,离心60分钟，即可达到目的。小型病毒如脊髓灰质炎、披膜病毒，则需以35000-45000rpm离心1-2小时。速度区带离心法是根据被分离物质在强大离心力中沉降速度不同而进行的分离方法。介质可以为均一密度，也可以梯度密度。当被分离的物质沉降到与介质密度相等的区域是就不再沉降。不同分子形成不同的区带，称为速度区带。常用的介质为蔗糖、甘油、聚蔗糖。常用的梯度范围从5%-20%:10%-60%。3-平衡密度梯度离心法大多数病毒的浮密度在1.10-1.40范围内；所制备密度范围为1.0-1.7的悬浮介质，便可满足大多数病毒密度梯度离心的需要。超滤法利用超滤膜将水、盐及小分子滤过，将一定大小的大分子或病毒等颗粒截住从而使后者得到浓缩的一种方法。第二节病毒蛋白亚单位的分离第三节病毒核酸的抽提第五章病毒的常规实验室诊断（4学时）教学目的：熟悉掌握病毒的常规实验室诊断方法。教学重点：病毒的血清学诊断。教学难点：病毒感染力的滴定和中和实验。基本教学内容：第一节病毒的初步鉴定病毒增殖的判定病毒在实验动物体、鸡胚和组织培养细胞内增殖，显然都会影响机体和细胞和生命活动，并经常通过一定的形态学和病理学变化表现出来。细胞病变（CPE细胞病变是病毒在细胞内增殖内增殖及其对细胞产生损害的最明显的表现， 包括胞浆的颗粒变性、胞核的变形和破裂。细胞病变经常具有病毒“种”的特性，可以作为病毒鉴定的依据之一。细胞代谢的测定PH值下降抗原的测定病毒间的干扰现象病毒感染力的滴定实验动物测定LD50（半数致死量）鸡胚上的EID50（半数鸡胚感染量组织细胞上测定TCID50（半数细胞培养物感染量）Reed-Muench法病毒液稀释度细胞管观察结果累计细胞管树E细胞管总数出现CPEffl胞管所占的％ /—-—\—出现CPE管不出现CP管E出BCPE管不出现CP管10-180270:27[100（27/27）10-2801901910010-371111129119/19）10-4354610（40侦劝0）10-517113140.7（1/14）10-608021210（0/21）出现细胞病变（CPE以及血凝素等的细胞管数分别列于表14-2的第2和第3列，它们的累计数分别列于第4和第5列（根据箭头所示方向），第6列为细胞管总数，第7列为出现细胞病变的细胞管数占细胞管总数的百分率。 可见该病毒株的TCID。在10-3（91.6%）和10-4（40%之间，其确切稀释倍数可按下列公式计算:91.6（高于50%勺百分数）一50 41.60.891.6（高于50%勺百分数）一40（低于50%勺百分数）51.6将由上式获得的0.8加在高于50溉亡的稀释度的对数（3）上，因此该病毒的TCID50应是0.1ml10-3.8稀释的病毒液。查反对数，得6310,即该病毒6310倍稀释液0.1ml等于1个TCID。5。病毒理化特性的测定病毒核酸型鉴定是DNA病毒，还是RNA病毒？脂溶性敏感性试验（1） 乙醚敏感性试验（2） 氯仿敏感性试验耐酸性试验胰蛋白酶敏感试验耐热性试验病毒粒子大小测定第二节病毒的免疫-血清学检测1.中和试验中和抗体：动物在受到病毒感染后，体内产生抗体，如果该抗体能与相应的病毒粒子特意性地结合，使后者丧失感染力，这种抗体称为中和抗体。中和抗体一般是针对病毒的蛋白衣壳或囊膜抗原的， 并不是针对病毒粒子的内部成分。应用已知的病毒或病毒抗原，可以测知患病动物体内中和抗体的存在及其效价。应用已知的抗病毒血清或中和性单克隆抗体， 也可以进行病毒的鉴定，因此中和试验也常用于新分离病毒株的鉴定。中和试验具有高度的敏感性和免疫特意性，常可用以侦察其他血清学反应难以测出的病毒株之间的抗原差异。进行中和试验，首先要选择试验宿主。（1）终点法中和试验有固定病毒一稀释血清法和固定血清一稀释病毒法固定病毒一稀释血清法：将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般100个TCID50EID50、LD50混合，置适当的条件下感作一定时间以后，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。以能保护50%&织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的50呦和效价。病毒稀释---血清---感作一

对照一接种一观察和解释一蚀斑减数试验蚀斑：用稀释的病毒液感染单层细胞，由于其致细胞病变作用，而在单层细胞上形成蚀斑。从理论上讲，一个病毒粒子形成一个蚀斑，因此根据蚀斑的大小、形状和色泽等性状，选择不同的代表进行移植传代，就有可能获得若干不同的纯系毒株。但在实际上，一个蚀斑往往由几十个乃至几百个病毒粒子形成。因此，由一个蚀斑分离获得的毒株常是许多个病毒的后代，需要进行反复多次的蚀斑分离，才有可能获得来源一个病毒粒子的“纯系”病毒。病毒+正常动物血清蚀斑数（平均）待检血清稀释+病毒中和后蚀斑数（平均）能使病毒蚀斑减少50%勺血清稀释度。交叉保护试验血凝和血凝抑制实验病毒+红细胞f凝集血凝的条件和特点：1822C最适宜操作方法：取血凝板，做好标记.按表1顺序和剂量加入各种材料表1.红细胞凝集试验的操作程序 单位：ul病毒稀1:2121:231:231:241:251:261:271:281:291:2101:211对释度生理盐25T25]25252525)25[}\}\2525}\}\25 25[2525 2525}\}\25}\25弃照八水 }\病毒25液}\}\25252525251%红细25252525252525 2525252525摇匀，放室温30min，观察结果。结果判定操作方法：2取血凝板作好标记按表4表搠顺红缅剂量加入各种材料操作顺序按表4表搠顺红缅剂量加入各种材料操作顺序单位：ul血清稀释度1:211:221:241:2525、1:261:271:281:291:210血1清病毒血球对照对照对照生理盐水252&\J25rA2525J\2525252550抗血清252525252525252525弃25——病毒液252525252525252525—25—1。卸细胞252525252525252525252525提高了病毒病的诊断水平。病毒病的实验室诊断技术已从常规的病毒分离鉴定以及抗原和抗体的免疫学检测，进入可对病毒基因序列和结构直接进行测定的分子生物学水平。病毒病的分子生物学诊断，包括对病毒核酸（ DNA或RNA和蛋白等的测定，关键在于测定这些分子的特异性序列或结构。病毒基因往往含有特异序列，可以用核酸杂交的方法予以检出，而这段序列的存在则说明了相应病毒的存在。虽然病毒是严格细胞内寄生的最小、最简单的生命形式，但也具有与宿主细胞不同的独特的核酸序列和基因结构。常用的分子生物学诊断技术包括基因组电泳分析、DNA酶切图谱分析、寡核苷酸指纹图、核酸杂交、聚合酶链式反应（PCR等。其中核酸杂交和PCF技术又以其特异、快速、敏感、适于早期和大量样品的检测等优点，成为当今病毒病诊断中最具有应用价值的方法。DNA杂交的灵敏度已经提高到0.05pg/ul，也就是说，只要有1000个DNA拷贝，就可能被检测出来。使用PCRS至可以检测出一个拷贝的DNA分子。第一节病毒核酸的提取技术悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解a） 于4C以2000g离心5分钟收集细胞，以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲液悬沉淀，洗涤细胞3次，每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀， 使其彻底分散。b） 估计细胞沉淀的体积，用10-20倍体积的RNA提取缓冲液重悬之。c） 加入与步骤b）所加RNA提取缓冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液，用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3-4次，剪切DNA。d）加蛋白酶K至终浓度为200pg/ml,充分混匀后置于37C温育30分钟。蛋白酶K以贮存的形式保存，贮存液为20pg/ml蛋白酶K水溶液。二提取步骤1） 用等体积酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白质。2） 用吊桶式转头于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相，将水相吸至一个新的离心管内，加2.5倍体积用冰预次序的乙醇，充分混匀，于0C放置1小时。3） 于0C以5000g离心10分钟沉淀RNA弃上清，用含0.1mol/L乙酸钠（pH5.2）的70%乙酸洗涤沉淀，用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽，随后于室温放置几分钟，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因为干的核酸沉淀很难溶解。4）每个直径为90mm的培养皿或每107细胞加200pl50mmol/LTris.Cl（pH7.8）1mmol/LEDTA（pH8.0）溶液重溶沉淀。5） 分别按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫苏糖醇（DTT，然后分别按1000单位/或10mmol/L的终深度加台盘RNA酶抑制剂或氧钒核苷复合物。6） 加入无RNA酶的胰DNA酶I至终浓度为2pg/ml,混匀，于37C温育60分钟7） 分别按10mmol/L和0.2%的终浓度加EDTA和SDS8）用等体积酚：氯仿抽提1次。9）于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相，将水相吸至另一个离心管内，加3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L,加2.5倍体积用冰预次的乙醇，充分混匀，冰浴放置2小时。10） 用微量离心机于4C以12000g离心5分钟沉淀RNA11）吸出所有的乙醇，将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，让最后残存的痕量乙醇挥发干净。12）用200plTE（pH7.6）重溶沉淀，力口500Pl乙醇，于一70C贮存备用。回收DNA时，只须取出1小份贮存液，加入3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L，充分混匀，用微量离心机于4C以12000g离心5分钟即可。三注意事项1测定最终所得溶液的OD260值可以确定RNA的浓度。取10Pl乙醇/TE混合液［步骤13） ］离心沉淀RNA以400水重溶，测定OD260值，OD260=1的RNA溶液每毫升约含40pgRNA如果需要，可用oligo（dT）一纤维素层析法从所制备的细胞总RNA中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的mRNA或购买试剂盒进行mRNA勺纯化。某些情况下（例如从感染了DNA病毒或用DNA转染的细胞中制备RNA寸），必须从细胞总RNA中去除寡脱氧核核苷酸。否则，当用这种RNA勾建cDNA库或进行引物延伸反应时应会出问题，反转录过程中法染的模板DNA片段可能会与RNA杂交而充当引物，从而导致物定mRNA5末端定位的错误或产生截短的cDNA克隆。a） 步骤12后，加200pl3mol/L乙酸钠（pH5.2），用自动微量移液器反复吹吸，以重悬核酸沉淀，将悬浮液移至另一个灭菌的微量离心管内。b）用微量离心机于室温以12000g离心10分钟，RNA沉于管底，而绝大部分寡脱氧核糖核苷酸仍在上清中。c）弃上清液，用200plT（pH7.6）重溶沉淀。加入20pl3mol/L乙酸钠（pH5.2）,分混匀，加入550pl用冰预冷的乙醇。混匀溶液，在冰上骤冷30分钟。用微量离心机于4C以12000g离主10分钟，以回收RNA小心吸出上清。d）弃上清液，用300plTE（pH7.6）重溶沉淀，力p1ml乙醇，一70C贮存备用。回收RNA时，只需取出1小份贮存液，加3mol乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L充分混匀，用微量离心机于4C以12000g离心5分钟即可。如需去除氧钒核糖核苷复合物，用含0.1%羟喹啉的苯酚［用0.01mol/LTris.Cl（pH7.8）平衡］将RNA终溶液抽提数次即可。对大多数细胞株来说，一个直径90mm培养甲中培养的RNA攵率为100-200pg第二节病毒的PCR佥测技术PCF技术概论PCF技术简史PCF技术的基本原理PCF反应体系与反应条件PCF反应特点PCRT增产物的分析聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用 PCF几小时便可完成。PCF技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。PCF技术简史PCR勺最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。PCF的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA勺体内复制，只是在试管中给DNA勺体外合成提供以致一种合适的条件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。PCR勺改进与完善Mullis最初使用的DNAK合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90°C会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在 37C下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCF技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于 Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCF技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR其扩增的DNA片段很均一,真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌（thermusaquaticus）中提取到一种耐热DNA聚合酶。酶具有以下特点：①耐高温，在 70C下反应2h后其残留活性大于原来的90%在93C下反应2h后其残留活性是原来的60%在95C下反应2h后其残留活性是原来的40%②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度（2.0Kb）。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶IKlenow片段区别，将此酶命名为TaqDNA多聚酶（TaqDNAPolymerase)。此酶的发现使PCR广泛的被应用。PCR技术的基本原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCRT增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNAS加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNAR合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 (Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝PCR的反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNAt增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算。丫代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，门代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCRt增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3'端开始延伸，其5'端是固定的，3'端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5'端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、 形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加， 而“长产物片段”则以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。PCRS应体系与反应条件标准的PCF反应体系：10X扩增缓冲液10ul4种dNTP昆合物各200umol/L引物模板DNATaqDNA引物模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+加双或三蒸水至各10100pmol0.12ug2.5u1.5mmol/L100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTR模板和Mg2+。引物：弓］物是PCF特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C3多易出现非特异条带。ATG（最好随机分布，避免5个以上的瞟吟或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1lumol或10100pmol,以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U（指总反应体积为100ul时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCRT增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装，-20C冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+吉合，使游离的Mg2浓度降低。模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA屯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA吉合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PC皈应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCRT增。RNA莫板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNAMg24浓度Mg2+寸PCRT增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PC皈应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2・浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+ft度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCF反应条件的选择PCF反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCF原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095C变性，再迅速冷却至4060C,引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075C,在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94E变性，65C左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCF失败的最主要原因。一般情况下，93C94rlmin足以使模板DNA变性，若低于93C则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCF产物完全变性，就会导致PCF失败。②退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40C60C，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%勺引物，55r为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）+2（A+T）复性温度=Tm值-（510E）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCF反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。③延伸温度与时间：TaqDNA聚合酶的生物学活性：7080r150核苷酸借/酶分子；70r60核苷酸/S/酶分子;55r24核苷酸/S/酶分子；高于90r时，DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在7075r之间，常用温度为72r，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数 循环次数决定PCRT增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。PCR反应特点特异性强：PCR反应的特异性决定因素为：①引物与模板DNA特异正确的结合；②碱基配对原则；^TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；④靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合（复性）可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。灵敏度高：PCF产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（ug=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR勺灵敏度可达3个RFU空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。简便、快速：PCF反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在24小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。对标本的纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞， DNA粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。PCF扩增产物的分析PCR产物是否为特异性扩增，结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCF产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。凝胶电泳分析：PCF产物电泳，EB漠乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。琼脂糖凝胶电泳：通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。酶切分析：根据PCF产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。Southern印迹杂交：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCF产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。斑点杂交：将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCF产物特异性鉴定及变异分析。核酸序列分析：是检测PCF产物特异性的最可靠方法。第三节病毒核酸杂交检测技术互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的，可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。杂交的双方是所使用探针和要检测的核酸。该检测对象可以是克隆化的基因组DNA也可以是细胞总DNA或总RNA根据使用的方法被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交，即细胞原位杂交。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素，但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，因而该技术在分子生物学领域中已广泛地使用于克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。因而它不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用，而且在临床诊断上的应用也日趋增多。第一节核酸探针标记的方法核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和RNA探针;根据是否使用放射性标记物的与否,可分为放射性标记探针和非放射性标记探针；根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针；根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。下面将介绍各种类型的探针及标记方法。一、双链DNA探针及其标记方法分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。双链DNA探针的合成方法主要有下列两种：切口平移法和随机引物合成法。切口平移法(nicktranslation)当双链DNA分子的一条链上产生切口时,E.coliDNA聚合酶I就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'f3'的核酸外切酶活性，能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响：(a)产物的比活性取决于[a-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。(b)DNA酶1的用量和E.coliDNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。(c)DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性，故应使用仔细纯化后的DNA。材料：待标记的DNA。设备：高速台式离心机，恒温水浴锅等。试剂：10X切口平移缓冲液：0.5mol/LTrisCl(pH7.2);0.1mol/LMgSO4;10mmol/LDTT;100pg/mlBSA。⑵未标记的dNTP原液:除同位素标记的脱氧三磷酸核苷酸外其余3种分别溶解于50mmol/LTrisCl(pH7.5)溶液中，浓度为0.3mmol/L。⑶[a-32P]dCTP或[a-32P]dATP:400Ci/mmol,10pCi/pl。E.coliDNA聚合酶I(4单位/pl):溶于50pg/mlBSA,1mmol/LDTT,50%甘油，50mmol/LTrisCl(pH7.5)中。DNA酶1:1mg/ml。EDTA:200mmol/L(pH8.0)。⑺10mol/LNH4Ac。操作步骤：(1)按下列配比混合：未标记的dNTP10yl、10X切口平移缓冲液5pI、待标记的DNA1g、［a-32P］dCTP或dATP(70pCi)7pl、E.coliDNA聚合酶4单位、DANSI1pl,加水至终体积50pl⑵置于15C水浴60分钟。⑶加入5plEDTA终止反应。反应液中加入醋酸铵，使终浓度为0.5mol/L,加入两倍体积预冷无水乙醇沉淀回收DNA探针。［注意］1、3H,32P及35S标记的dNTP都可使用于探针标记，但通常使用［a-32P］-dNTP。2、DNA酶1的活性不同，所得到的探针比活性也不同， DNA酶1活性高，则所得探针比活性高，但长度比较短。2.随机引物合成法随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。利用随机引物进行反应的优点是：(1)Klenow片段没有5'-3'外切酶活性,反应