授课31菊花组织培养

第一页，共四十九页。第二页，共四十九页。植物的组织培养第三页，共四十九页。

菊花是菊科菊属的多年生宿根草本植物,是我国的传统名花和世界四大切花之一。长期以来菊花采用分株、扦插等无性繁殖方法进行繁殖。但是传统的繁殖方法易受环境影响,繁殖周期长,随着市场需求的急剧增加,已经不能满足市场日益发展的需要。

植物组织培养属于无性生殖中营养生殖营养生殖包括：第四页，共四十九页。扦插第五页，共四十九页。嫁接第六页，共四十九页。压条

第七页，共四十九页。一、基础知识1、细胞分化（1）概念：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构、功能上产生稳定性差异的过程。（2）特点：持久性：发生在整个生活活动过程中，胚胎期分化程度达到最大。不可逆性：稳定性：分化过程，遗传物质是不变的，稳定的。（3）原因：（4）结果：基因选择性表达的结果产生不同的组织和器官第八页，共四十九页。2、植物细胞的全能性（1）概念：（2）比较：（3）原因：（４）表达的条件：高度分化的植物细胞，仍具有发育成完整植株的潜能。体细胞中：分生区细胞＞成熟区细胞高度分化的动物体细胞全能性受到限制，但体细胞核仍具有全能性。受精卵＞生殖细胞＞体细胞体细胞都是通过有丝分裂由同一个受精卵增殖形成的，遗传物质（染色体）相同，携带有本物种的全部遗传信息。离体、在一定的营养物质、激素和其它外界条件(适宜的温度、PH值、光照等)才能表达。第九页，共四十九页。3、植物组织培养（1）概念：（2）过程：人工种子植株外植体愈伤组织胚状体脱分化再分化加上人工种皮是指离体的植物器官、组织或细胞，在无菌条件下，通过脱分化和再分化形成完成植株的过程。第十页，共四十九页。（3）植物组织培养细胞离体①必要条件：一定的营养物质、激素和其他外界条件②原理:细胞的全能性A.外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官.③相关概念:第十一页，共四十九页。B愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞通过脱分化形成的疏松而无规则的，高度液泡化的呈无定形状态的,未分化的薄壁细胞2-3周，愈伤组织开始形成。第十二页，共四十九页。菠萝的愈伤组织第十三页，共四十九页。C脱分化（去分化）：已经分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程。

(已经分化的植物器官、组织或细胞，当受到创伤或进行离体（也受到创伤）培养时，已停止分裂的细胞，又重新恢复分裂，细胞改变原有的分化状态，失去原有结构和功能，成为具有未分化特性的细胞。)第十四页，共四十九页。D再分化：愈伤组织继续培养，重新分化成根和芽等器官的过程。

3-5周之后，诱导出的新叶片和芽。第十五页，共四十九页。E胚状体：具有胚根和胚芽的结构胚状体包裹着人工胚乳和人工种皮可以制成人工种子。第十六页，共四十九页。第十七页，共四十九页。第十八页，共四十九页。二、影响植物组织培养的因素环境条件：适宜光照、温度、PH外因内因：植物种类，同一种植物材料的年龄、保存时间的长短

，营养：矿质元素：大量元素，微量元素植物激素：细胞分裂素，生长素

有机物：蔗糖、氨基酸等环境条件：适宜光照、温度、PH营养：矿质元素：大量元素，微量元素植物激素：细胞分裂素，生长素

有机物：蔗糖、氨基酸等环境条件：适宜光照、温度、PH营养：矿质元素：大量元素，微量元素植物激素：细胞分裂素，生长素

有机物：蔗糖、氨基酸等环境条件：适宜光照、温度、PH营养：矿质元素：大量元素，微量元素植物激素：细胞分裂素，生长素

有机物：蔗糖、氨基酸等环境条件：适宜光照、温度、PH营养：矿质元素：大量元素，微量元素植物激素：细胞分裂素，生长素

有机物：蔗糖、氨基酸等环境条件：适宜光照、温度、PH营养：矿质元素：大量元素，微量元素植物激素：细胞分裂素，生长素

有机物：蔗糖、氨基酸等第十九页，共四十九页。2、影响植物组织培养的因素（1）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝第二十页，共四十九页。（2）离体的植物组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基MS培养基主要成分包括：A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等C、有机物第二十一页，共四十九页。讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？答：微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。

第二十二页，共四十九页。2、高等植物是光能自养型生物，为什么在植物组织培养过程中还需要提供有机物培养基？？此时的组织或细胞为离体的，细胞所生活的环境为液体有机物营养环境，而不能体现其整个植物体的光能自养。思考第二十三页，共四十九页。①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素生长素类：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）细胞分裂素类：激动素（KT）、6－苄基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）赤霉素类：赤霉酸（GA3）（3）植物激素的影响第二十四页，共四十九页。②生长素和细胞分裂素作用植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞既分裂也分化同时使用分化频率高第二十五页，共四十九页。生长素细胞分裂素：>有利于根的分化生长素细胞分裂素：<有利于芽的分化，抑制根的分化生长素细胞分裂素：＝促进愈伤组织生长③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响（4）pH、温度、光照pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每日用日光灯照射12h.第二十六页，共四十九页。生长素/细胞分裂素第二十七页，共四十九页。3、植物组织培养过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素>生长素细胞分裂素<生长素再分化植物细胞培养不需要光?需要光第二十八页，共四十九页。同常规的无性繁殖方法相比，组织培养快速繁殖法主要具有以下优点：（1）快速。采用常规的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生产几株或几十株，但用组织培养的方法则每年可以繁殖出几万甚至数百万的小植株。（2）周年生产。花卉组织培养快速繁殖是在实验室中进行，因条件可控，所以不受季节限制，可以全年进行连续生产。而常规的无性繁殖则受季节限制，只能在花卉生长季节进行繁殖。（3）经济效益高。花卉组织培养快速繁殖所需要的空间小，在一个200平方米的培养室内一年可生产试管苗上百万株。如按每株1元计算，每年产值上百万元。（4）以组织培养繁殖的种苗与母株有著相同的遗传基因。所以使用这项技术可让优良的品种不断地延续。组织培养与常规繁殖相比优点众多第二十九页，共四十九页。二、实验操作（一）制备MS固体培养基MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备.1、配置各种母液第三十页，共四十九页。①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存.②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液.③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量.第三十一页，共四十九页。2、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml.①配制培养液②调PH③培养基的分装由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素.第三十二页，共四十九页。3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌.1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝.（二）外植体消毒2、消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右.第三十三页，共四十九页。②酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗.③消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液.第三十四页，共四十九页。（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟1、接种室消毒2、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3、材料的切取和接种第三十五页，共四十九页。第三十六页，共四十九页。4、接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种.②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件.③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分.第三十七页，共四十九页。1、培养基的灭菌（高压蒸汽灭菌）2、外植体的消毒（酒精、氯化汞）3、接种的无菌操作（酒精、酒精灯——灼烧）4、无菌箱中的培养；5、移栽到消过毒的环境中生存一段时间。在整个操作过程中，是如何来实现无菌环境的？第三十八页，共四十九页。思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。第三十九页，共四十九页。（四）培养1、愈伤组织的培养从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养.第四十页，共四十九页。继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为1－1.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养.2、愈伤组织的继代培养在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色.第四十一页，共四十九页。3、试管苗的培养当愈伤组织长到一定大小后，可以更换培养基，进行试管苗的见光培养.（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日.1、打开封口膜2、清洗转移用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间.第四十二页，共四十九页。（六）栽培3、移栽珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培.幼苗长壮后，移栽到土壤中.幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗