核酸检测技术在棘球蚴病诊断的应用

PAGEPAGE8【摘要】棘球蚴病是一种严重危害公共健康的人兽共患寄生虫病。由于影像学和免疫学诊断存在一定局限性，近年来国内外学者针对病原体棘球绦虫建立了多种核酸检测方法，主要包括聚合酶链式反应(polymerasechainreac-tion，PCＲ)、多重引物PCＲ(multiple－PCＲ)、实时荧光定量PCＲ(qＲT－PCＲ)、环介导等温扩增核酸技术(LAMP)等，本文对这些方法的应用研究进行了归纳，探讨这些检测方法在棘球蚴病诊断中意义。【关键词】棘球蚴病;核酸检测;细粒棘球绦虫;多房棘球绦虫棘球蚴病(俗称包虫病)，是棘球属绦虫的中绦期幼虫寄生于人或动物体内引起的一种危害严重的人兽共患寄生虫病，呈世界性分布，被世界卫生组织列为被忽视的热带病之一。目前全球公认的棘球绦虫有五种，分别是细粒棘球绦虫(E．granulosus)、多房棘球绦虫(E．multilocularis)、伏氏棘球绦虫(E．vo-geli)、少节棘球绦虫(E．oligarthrus)、石渠棘球绦虫(E．shiquicus)。细粒棘球绦虫病呈全球性分布［1］，在大洋洲、欧洲、亚洲、非洲和美洲等畜牧产业发达的地区发病率较高。全球每年遭受细粒棘球蚴病(囊型包虫病)和泡型棘球蚴病(泡型包虫病/泡球蚴病)危害的人数分别为300万和65万［2］。我国包虫病人群患病率为0．24%，患病人数约17．4万［3］，以囊型包虫病为主，这与全球流行情况基本一致。目前棘球蚴病的诊断依据主要包括流行病学史、临床症状体征、病原学检测［4］、核酸检测［5－6］、免疫学［7－8］和影像学诊断。由于棘球蚴在人体内发育较慢，早期体积较小，影像学技术(B超、CT、MＲI)在感染早期不易发现病灶;感染早期，由于抗体水平较低或现有诊断试剂敏感性和特异性不高，免疫学检测可能出现假阳性或假阴性。因此，免疫学和影像学诊断技术都存在一定局限性，不利于棘球蚴病的早期诊断。核酸检测技术具有所需样本量少、敏感性高、特异性强、反应快速等优点，已被广泛应用于肿瘤［9］、细菌感染［10－11］、病毒感染及寄生虫病［12－14］等临床诊断。近年来国内外学者针对棘球蚴病诊断进行了一些核酸检测技术的研发和应用，本文综述如下。1常规PCＲ聚合酶链式反应(PCＲ)发明于20世纪80年代，即在体外模拟DNA合成过程，在酶促合成反应条件下，通过控制温度和时间对目的核酸片段进行指数级扩增。因其灵敏度高、特异性好、成本低、省时高效等优点，逐渐成为核酸检测的重要手段。2017年，Hamza［15］等根据线粒体基因12SrＲNA为靶标建立了PCＲ方法，对48只啮齿动物肝脏病灶检测，检出5只感染多房棘球绦虫。2019年，Mary-am［16］等以细粒棘球绦虫COX1和NADH1为目的基因建立PCＲ方法，分析了伊朗80例棘球蚴病患者的临床标本，血清样本的棘球绦虫基因阳性率分别为15．0%和10．0%，包囊组织的棘球绦虫基因阳性率分别为91．3%和83．8%。John［17］等以NADH1和NADH5为目的基因建立PCＲ方法，对来自羊及耗牛的85份囊液标本进行鉴定，结果均为细粒棘球蚴，其中G1基因型77份，G3基因型6份，G6基因型2份，该研究首次在西藏牦牛体内检测到G6基因型。少节棘球绦虫和伏氏棘球绦虫报道较少。2013年，Soare［18］根据COX1建立PCＲ方法，对人体分离的肝包囊进行核酸扩增和测序，最终证实病原体为少节棘球绦虫。2018年，Fernanda［19］等根据COX1建立PCＲ方法，对豚鼠分离的包囊进行核酸检测，测序结果提示为伏氏棘球绦虫。2多重引物PCＲ多重引物PCＲ(Multiplex-PCＲ)技术原理与常规PCＲ无差异，区别在于反应体系中至少有两对特异性引物，一次反应即可完成多个目的基因的检测，大大提高了检测效率。与常规PCＲ技术相比，mul-tiplex-PCＲ技术具有快速、准确等优点，在鉴别不同物种基因方面具有独特优势。2011年，Molouk［20］等以NADH1和rＲNA为目的基因建立了multiplex-PCＲ方法，目的片段长度分别为395和117bp，可以鉴别多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫。2016年，Ka-rin［21］等根据NADH1和rＲNA小亚基(Cest3、Cest4和Cest5)基因建立了multiplex-PCＲ方法，该方法能够同时鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫感染，可用于监测两型包虫病混合流行情况。2018年，Ger-ald［22］等利用细粒棘球绦虫的两个特异性微卫星(EgSca6和EgScall)分别建立了PCＲ和mulitiple-PCＲ方法，PCＲ方法分辨指数分别为0．824和0.987，而mulitiple-PCＲ显示出了极高的分辨指数(0.994)，提示mulitiple-PCＲ方法有较好的应用前景。根据遗传学特征目前最广为接受的理论［23］，囊型棘球蚴病的致病原由4个棘球绦虫复合种构成:狭义细粒棘球绦虫(E．granulosussensustrict)、奥氏棘球绦虫(E．ortleppi)、马棘球绦虫(E．equinus)、加拿大棘球绦虫(E．canadensis)。2019年，Jing［24］根据atp6、NADH1和rrnL序列作为检测靶标建立multi-plex-PCＲ方法，可以同时检测狭义细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和加拿大棘球绦虫，multiplex－PCＲ鉴定结果与原始测序结果一致，对3种棘球绦虫检出限均为5pg/μL。用相同浓度3种混合模板进行检测，对细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、加拿大棘球绦虫的检出限分别为50、10和5pg/μL，表明multi-plex-PCＲ在快速诊断和流行病学调查方面具有优势。2019年，Fan［25］等根据狭义细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、加拿大棘球绦虫线粒体基因设计种属特异性引物，并建立了multiplex-PCＲ方法，其中狭义细粒棘球绦虫和加拿大棘球绦虫检测限仅为0．32pg，多房棘球绦虫检测限为1．6pg，除与石渠棘球绦虫有微弱交叉反应外，可与其他7种绦虫进行鉴别，显示了较好的敏感性和特异性。3实时荧光定量PCＲ实时荧光定量PCＲ(Ｒeal-timePCＲ)利用荧光染料或探针，实时监测核酸扩增过程中产生的荧光信号，并通过Ct值和标准曲线准确定量样本目的基因的初始拷贝数。相比于常规PCＲ方法，Ｒeal-timePCＲ具有特异性更强、自动化程度高等优点，已经成为核酸定量检测的重要手段。miＲNA能够在宿主的血清或血浆中稳定存在，对于疾病诊断和疗效评价具有重要意义，近年来已成为研究热点。2017年，Guo［26］等通过测序分析在疾病模型的小鼠血清中找到7种多房棘球绦虫特异性miＲNA，通过real-timePCＲ检测发现emu-miＲNA-10和emu-miＲNA-227表达水平显著上调，对于疾病诊断和了解宿主－虫体相互作用具有重要意义。2018年Alice［27］等利用U1snＲNA和NADH5基因片段建立了real-timePCＲ和微滴式数字PCＲ(dd-PCＲ)方法，检测到泡球蚴病患者和患病动物血清中循环游离DNA(ccf-DNA)均为阳性，但由于泡球蚴病患者体内检测到的ccf-DNA浓度过低，目前该方法还不能用于泡球蚴病诊断。2019年，Ｒen［28］等利用real-timePCＲ比较60名健康人和47名多房棘球绦虫病患者血清中3种microＲNA的表达水平，发现患者miＲNA－483－3p显著上调，可作为疾病诊断的候选标志物。2019年，Zahra［29］等建立real-timePCＲ方法并对30名细粒棘球蚴病患者血浆进行检测，发现egr-miＲ-r71和egr-let－7表达上调;术后3个月和6个月分别对患者血浆再次进行检测，两种miＲNA表达水平明显下调，提示该方法可以用于疾病早期诊断和疗效监测。4环介导等温扩增技术(LAMP)环介导等温扩增技术(LAMP)是一种新型的核酸检测方法，该方法不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳和紫外观察等过程，可以在等温条件下一步完成，并通过肉眼读取结果。因其具有简单快速、特异性强、成本低等优点，已成为核酸检测技术的研究热点。2014年，Marion［30］利用NADN1基因建立了一种高效的LAMP方法，可以准确鉴别狭义细粒棘球绦虫、马棘球绦虫、奥氏棘球绦虫、加拿大棘球绦虫及狮棘球绦虫(E．felidis)。2016年，Ahmed［31］根据线粒体基因NADH1为靶标建立了LAMP方法，检测限为10fg，具有较高的敏感性，通过肉眼可以直接判断阳性结果，而且与血吸虫、片形吸虫、牛囊尾蚴等无交叉反应，具有流行区现场筛查的应用价值。5基于PCＲ的其他检测方法PCＲ-ＲFLP技术(限制性片段长度多态性聚合酶链反应)是用特异设计的引物扩增目的基因，对扩增产物片段进行酶切处理，以检测其多态性。2012年Canan［32］等根据ITS－1和NADH1基因分别建立了PCＲ-ＲFLP和PCＲ-SSCP方法，其中PCＲ-ＲFLP可以通过不同的限制性切酶产物鉴别细粒棘球绦虫的基因型，而PCＲ-SSCP能够通过肉眼就可以直接鉴别细粒棘球绦虫的基因型。2014年，Cagrl［33］等根据细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫线粒体特异性基因建立PCＲ-ＲFLP方法，分析4种不同限制性内切酶的酶切产物鉴别两种虫体，其中3种酶(MboⅠ、MboⅡ、AccⅠ)只能酶切多房棘球绦虫基因组PCＲ产物，而TSol只能酶切细粒棘球绦虫基因组PCＲ产物，可以准确鉴别两种虫体。2019年，Fallahizadeh［34］等采用狭义细粒棘球绦虫ITS－1基因建立了PCＲ-ＲFLP方法，使用4种不同的限制性内切酶酶切PCＲ扩增产物。其中AluⅠ酶切产生800和200bp，HpaⅡ酶切产生700和300bp，Ｒsa酶切产生655和345bp，而TaqⅠ不能酶切PCＲ产物。6小结棘球蚴病是危害严重的人兽共患寄生虫病，对