核酸的提取及相关

关于核酸的提取及相关第1页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五I.质粒DNA的提取、分离和纯化第2页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五一、质粒的基本性质

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、共价闭合环状DNA分子（covalentlyclosedcircularDNA,简称cccDNA）

，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主的复制和转录系统，但质粒的复制和转录需要宿主细胞编码的某些酶和蛋白质。此外，质粒还具有编码某些酶的基因，如对抗生素的抗性等。

第3页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五质粒在细胞内的复制一般有二种：紧密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子；后者在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上。在细胞培养过程中，加适当氯霉素可使松弛型质粒的拷贝数由原来的20多个扩增至1000-3000个。

第4页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五质粒的不相容性（incompatibility）

利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时进入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞过程中相互竞争，只有一种质粒占优势。这样，过几代后，占小数的质粒将丢失，在细胞后代中只有二种质粒中的一种。这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。但利用不同复制系统的不同质粒可在同一宿主细胞中共同存在。第5页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五二、质粒DNA的制备基本原理(碱法）

从细胞中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA.①采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，SDS和TritonX-100可使细胞膜裂解。②处理后细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。③当用强热或酸、碱处理时，细菌的线形染色体DNA变性，而cccDNA的二条链不会相互分开。④当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。⑤通过离心可获得质粒DNA。第6页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五三、试剂LB液体培养基:

蛋白胨（tryptone）10g,酵母提取物（yeastextract）5g,NaCl10g,用NaOH调至pH7.2-7.5。高压下蒸汽灭菌20分钟。LB固体培养基：每升液体培养基加12g琼脂粉，高压下蒸汽灭菌20分钟。氨苄青霉素（Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20

℃下保存备用。溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTrisCl(pH8.0),10mmol/LEDTA(pH8.0).高压蒸汽灭菌15分钟,储存于4oC冰箱。溶液II：0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/LNaOH母液稀释)，1%SDS.溶液III:5mol/LKAC60ml,冰醋酸11.5ml,水28.5ml.RNaseA母液：将RNaseA酶粉溶于10mmol/LTrisCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl,终浓度为10mg/ml。100℃加热15分钟，冷却后分装。饱和酚：市售酚需重蒸。重蒸后加0.1%8-羟基喹啉，并用等体积的0.5mol/LTrisCl(pH8.0)和0.1mol/LTrisCl(pH8.0)缓冲液反复抽提，使pH达到7.6以上。氯仿：按氯仿/异戊醇=24：1混合。酚/氯仿：将上述饱和酚和氯仿按1：1混合。TE缓冲液：10mol/LTrisCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0).高压蒸气灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。第7页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五四、操作步骤1．细菌的培养和收集：将含有质粒pBS的DH5菌株接种在LB固体培养基（含50g/mlAmp）中，37℃培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基（含50g/mlAmp）中，37℃培养约12小时至对数生长后期。2．

质粒DNA的少量快速提取---碱裂解法

1).

取1.5ml培养液倒入1.5mlependorf管中，4℃下12000g离心30秒。

2).

弃上清，将管倒置于卫生纸上数秒钟，使液体流尽。

3).

菌体沉淀重悬浮于100l溶液I中（激烈震荡，充分混匀），室温下放置5-10分钟。

4).

加入新配制的溶液II200l，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒ependorf管数次，以混匀内容物（千万不要震荡）中，冰浴中放置5分钟。

5).

加入150l预冷的溶液III，盖紧管口，并倒置离心管，温和颠倒

ependorf管数次，以混匀内容物，冰浴中放置5-10分钟。4℃下

12000g离心5-10分钟,取上清。第8页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五6).将上清液移入干净ependorf管中，加入等体积的酚/氯仿(1:1)，震荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。7).将上清液移入干净ependorf管中，加入等体积的氯仿，震荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。8).

将水相移入干净ependorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，震荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟。然后在4℃下12000g离心10分钟。9).

弃上清液，将管口敞开并倒置于卫生纸上，使液体流尽。加入1ml70%乙醇洗涤沉淀。4℃下12000g离心5-10分钟。10).

吸去上清液，将管倒置于卫生纸上，使液体流尽，室温干燥或真空干燥10分钟.11).将沉淀溶于20lTE缓冲液（pH8.0,含20g/mlRNaseA）中，储于-20℃

C冰箱.

第9页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五附:

日常型质粒DNA小量纯化试剂盒

（硅膜吸附）原理：带负电荷的DNA和带正电的二氧化硅粒子有很高的亲和力。阳离子Na发挥桥梁作用，吸附核酸磷酸盐骨架上带负电荷的氧，在高盐的酸性条件下，Na+

打破水中的氢和二氧化硅上带负电荷的氧离子间的氢键，DNA与二氧化硅紧密结合，先洗涤除去其他杂质，再用低离子强度的TE缓冲液或蒸馏水洗脱结合的DNA分子。第10页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五该试剂盒沿用传统的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的。适合于从4mlLB细菌培养物中提取5～20ug纯净的质粒DNA，用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。第11页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五第12页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五操作步骤

第一次使用时，将试剂盒携带的RNaseAl全部加入到S1溶液中，混合均匀，4℃保存。1．取3ml在LB培养基中培养过夜的菌液(若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少)，12000rpm离心20s，弃尽上清；2．用0.25ml已加入RNaseAl的S1溶液悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；3．加0.25mlS2溶液，温和并充分地上下翻转混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min；4．加入0.5ml4℃预冷的S3溶液，温和并充分地上下翻转混合均匀，直至形成紧实的凝集块，室温静置2min。最高速度(12000rpm)离心5min；第13页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五操作步骤(续)5．吸取步骤4中的离心上清并转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，3600rpm离心lmin。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1min，弃滤液；6．将制备管置回离心管，加0.5mlWl溶液，3600rpm离心30s，弃滤液；7．将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s；以同样的方法再用0.7mlW2溶液洗涤一次。弃滤液；8．将制备管移入离心管中，12000rpm离心1min；9．将制备管移入新的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加60μl水或洗脱液，室温静置lmin。12000rpm离心lmin洗脱DNA。第14页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五质粒DNA电源图第15页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五磁珠法提取DNA原理1994年T．L．Hawkins等发现羧基高分子表面在一定浓度PEG／NaCl条件下具有吸附核酸的能力，而在水或TE溶液中核酸又可以解吸附。因此，在磁珠表面连接可特异地与DNA发生作用的功能基团，使其具有可逆吸附DNA的特性。通常采用带有氨基、巯基、环氧基等基团的活化试剂对磁珠表面包覆的高分子进行化学修饰。高盐离子浓度下多聚核苷酸与羧基修饰的磁珠表面可发生非特异性吸附，而蛋白、单糖、多糖和脂类等细胞成分不被吸附的原理，这样就建立了一种以磁性微珠为载体的DNA纯化方法。相对微米或亚微米级载体，纳米磁性粒子具有尺寸小、偶联容量大、悬浮稳定性高及超顺磁性等优点，便于各种反应高效快速进行。第16页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五

该核酸提取法对DNA结构没有损伤，生物相容性高，DNA可直接洗脱应用，纯度及纯化效率等方面都较高。第17页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五II、基因组DNA的提取第18页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五一、概述

染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等，同时在目前广受人们关注的生物基因组学研究中是最重要的研究目标。1、基因组文库的构建：当用于构建基因组文库时，所得的染色体DNA的片段长度应尽可能的长（至少应大于需克隆片段的4倍）。当用Cosmid构建文库时，片段长度应大于200kb;用噬菌体构建文库时应大于80kb。但在制备过程中，有机溶剂的抽提、震荡、反复抽提和乙醇沉淀等步骤都会造成DNA断裂。我们应尽可能采用温和的方法和手段。2、Southern杂交：用于Southern杂交的染色体DNA片段长度要求可适当降低。3、PCR\AFLP\RFLP等：DNA片段长度要求可适当降低。第19页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五一、概述

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同；同种生物的不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时，必须参照文献和经验建立的相应提取方法，以获得可用的DNA大分子。不同的植物材料提取的方法有差异，主要在提取缓冲液的成分上，如李、苹果的植物的染色体DNA提取所用的提取缓冲液为：18.6g葡萄糖、6.9g二乙基二硫代碳酸钠（Sarkosyl）、6.0gPVP、240ul巯基乙醇、加水至300ml第20页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五二、植物基因组DNA提取

(水稻和其它禾本科植物)1、试剂

A.提取缓冲液：100mmol/LTris·Cl（pH8.0）、

20mmol/LEDTA、500mmol/LNaCl、1.5%SDS。

B.氯仿/戊醇/乙醇溶液:80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇

C.异丙醇

D.TE:10mol/LTrisCl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0).

高压蒸气灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。

E.RNaseA：10mg/mlF.3mol/LNaAC第21页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五2、实验步骤在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液，60℃水浴预热。水稻幼苗或叶子5-10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的含提取缓冲液的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30-60分钟（时间长，DNA产量高），不时摇动。加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层（必要时可重新混匀）。室温下5000rpm离心5分钟。仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。转入含1mlTE

的1.5mleppendorf管中，DNA很快溶解于TE。如DNA不形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。第22页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五2、实验步骤(续）H.

将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。I.加入5ulRNaseA（10ug/ul），37℃10分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作分析一般无影响，可省略该步骤）。J.加入1/10体积的3mol/LNaAC及2x体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。K.用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。L.将DNA重新溶解于1mlTE中，-20℃贮存。M.取2ulDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时可取15ul稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。第23页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五3、DNA纯度与浓度测定A、DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。

OD260/OD2801.8：说明较纯；

OD260/OD2801.8：说明可能有RNA污染；

OD260/OD2801.8：说明可能有蛋白质污染。B、DNA浓度：当OD260为1时，dsDNA含量为50ug/ml,ssDNA或RNA含量为40g/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml.[dsDNA]（µg/ml）=50×OD260×稀释倍数第24页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五附:动/植物基因组DNA小量纯化试剂盒1、基本原理：该试剂盒采用公司自身研制的相分离技术和DNA制备膜选择性吸附DNA

的原理从1-10mg新鲜动物组织或2-20mg新鲜植物组织中提取至多20ug纯净的染色体DNA.

第25页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五2、实验步骤

样品收集：100mg新鲜植物叶片，剪刀成小块，放入研钵中，加入液氮，使植物组织冷冻完全后，快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮防止组织融化。研磨充分后将研钵放入65℃水浴至样品粉末刚开始融化。加入700ulG-A溶液和1.2ulRNaseA1贮存液，用力研磨30秒。转移650ul研磨好的匀浆至2ml离心管中，如体积不到650ul,加bufferG-A溶液至650ul,65℃下保温15min。加400ulG-B溶液和1mlDV溶液(4℃预冷），用力混匀，12000g离心2min.去上相液体，保留间相和下相溶液。加入1mlDV溶液(4℃预冷），用力混匀，12000g离心2min.去上相液体，将下相溶液转移至微量滤器(置于2ml离心管中）。12000g离心30秒。第26页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五2、实验步骤弃上相，在过滤液中加入400ulDV溶液,混合均匀。将制备管置于2ml离心管中，加入步骤G的样品。12000g离心30秒。弃滤液，将制备管置于原2ml离心管中,加入500ulWl溶液，12000g离心30秒。弃滤液，将制备管置于原2ml离心管中,加入700ulW2溶液，12000g离心30秒。弃滤液，将制备管置于原2ml离心管中,加入500ulW2溶液，12000g离心1min。将制备管移入新的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加100-200μl水或洗脱液，室温静置lmin。最高速度离心lmin洗脱DNA。第27页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五三、细菌基因组DNA提取1、试剂10%SDS蛋白酶K(20mg/ml)氯仿：异戊醇（24：1）;苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）70%乙醇TE,5mol/LNaCl.RNaseA：10mg/mlCTAB/NaCl溶液：4.1gNaCl溶解于80mlH2O中，缓慢加入10gCTAB,加水至100ml.(NaCl:Mr.58;0.8Mol/L)第28页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)

CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性。在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里。

在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数多聚糖(除酸性多聚糖)形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此CTAB可以用于从大量产生黏多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌(包括大肠杆菌的某些株)中制备纯化DNA。

CTAB在制备基因组DNA的基本沉淀程序：这种去污剂加入调节至高离子强度(>0.7mol/LNaCl)的细菌或细胞裂解液中。经过连续的酚和氯仿抽提去除CTAB／黏多糖／蛋白质复合物，用异丙醇／无水乙醇沉淀上清即可获得基因组DNA。第29页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五CTAB结构式第30页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五2、实验步骤：5ml细菌培养过夜，12000rpm离心3分钟，去上清液。加567ulTE溶液悬浮沉淀，并加30ul10%SDS,3ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀，37℃水浴保温1小时。加100ul的5mol/LNaCl,混匀。加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃水浴保温10min.用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，12000rpm离心3分钟。仔细移取上清液至另一离心管中，加入一倍体积异丙醇，混匀，室温下放置10min,即出现絮状DNA沉淀。用勾状玻璃棒捞出DNA絮团，在70%乙醇中漂洗后在干净吸水纸上吸干，室温下干燥后转入100ul的TE溶液中，DNA很快溶解于TE。保存于-20℃。取2ulDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15ul稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。第31页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五附注如需降解RNA,则在步骤G后加入5ulRNaseA（10ug/ul），37℃保温30分钟，除去RNA（RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，5000rpm离心10分钟。上清液至另一离心管中，加入1/10体积的3mol/LNaAC及2x体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，使DNA形成絮状沉淀。用玻棒捞出DNA沉淀，70%乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。将DNA重新溶解于1mlTE中，-20℃贮存。第32页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五附:细菌基因组DNA小量制备试剂盒实验步骤：样品收集：1ml细菌培养液5000rpm离心3分钟，用0.8ml细菌原生质体制备缓冲液悬浮沉淀，加20ul溶菌酶贮存液，冰上放置10min.加0.3ml的0.25MEDTA,pH8.0,混合均匀，冰上放置5min。加0.3ml洗脱液，37℃保温5min.5000rpm离心5min.去上清，加0.1mlS-G溶液，彻底悬浮沉淀，冰浴5min.加0.45ml50℃预热的G-A溶液，用1ml枪头快速吸注10次；若太粘稠，则在45℃下保温5min,再用1ml枪头快速吸注10次。冰浴5min.加0.15mlG-C溶液，混匀，12000rpm离心1min.将样品加于微量滤器（置于2ml离心管中），12000rpm离心1min.第33页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五实验步骤（续）吸取步骤E中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管中)，3600rpm离心1min。如制备管中有液体残留，适当提高离心速度，再离心1min，弃滤液；将制备管置回离心管，加0.5mlWl溶液，3600rpm离心30s，弃滤液；将制备管置回离心管，加0.7mlW2溶液，3600rpm离心30s；以同样的方法再用0.7mlW2溶液洗涤一次。弃滤液；将制备管置于离心管中，12000rpm离心1min.将制备管移入新的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加60μl水或洗脱液，室温静置1min。最高速度离心1min洗脱DNA。第34页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五细菌基因组DNA电源图第35页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五真核细胞基因组DNA电源图第36页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五III、总RNA的制备第37页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五一、概述

中心法则:DNAmRNA蛋白质

真核生物mRNA的特点:真核生物的基因中有许多内含子,需要通过RNA的拼接加工,才能成为成熟的mRNA.因此真核生物中提取的mRNA,经反转录合成cDNA,进而克隆基因已成为分子生物学最重要的方法之一.

通常一个典型哺乳动物细胞约含10-5ugRNA,但其中大部分为rRNA（28S,18S及5S）和各种低分子量的RNA(tRNA,小核RNA等),只有1-5%为mRNA。这些mRNA的大小和序列不一,

但其3’端有一个poly(A)的结构，它编码了所有由该细胞合成的多肽。第38页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五实验器皿处理

mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定而且广泛存在，因此，在提取过程中应严格防止RNA酶的污染并设法抑制其活性，这是实验成败的关键。人的皮肤、手指、试剂、容器等均可被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液处理，再用蒸馏水冲净。为了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需经硅烷化处理。第39页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五RNA酶抑制剂A.焦碳酸二乙酯（DEPC）:

强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。但DEPC能与胺与巯基反应，因而含Tris溶液和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制后、然后高压灭菌。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物！B.异硫氰酸胍（Guanidiniumisothiocyanate）:

为目前一种最有效的RNA酶抑制剂。它不但具有败坏细胞结构、核酸从核蛋白质中解离，同时也使RNA酶失活。因此在制备RNA时，缓冲液中常含有异硫氰酸胍。C.其它：钒氧核苷酸复合物（Vanadyl-ribonuclosidecomplex）

RNA酶蛋白抑制制（RNasin）

SDS,尿素等第40页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五二、试验方法

细胞内总RNA制备方法很多，如异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法等。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。

第41页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五酚/SDS法制备总RNA1基本原理：

第一步用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质，第二步用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA和其它不纯物。2、试剂匀浆缓冲液：0.18mol/LTris,0.09mol/LLiCl,4.5mmol/LEDTA,1%SDS,pH8.2）TLE：0.2mol/LTris,0.1mol/LLiCl,5mmol/LEDTA,pH8.2经平衡的酚LiCl3mol/LNaAC无水乙醇第42页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五3、实验步骤植物组织在液氮中磨成粉末，转入含150ml匀浆缓冲液和50ml经TLE平衡的酚的500ml烧杯中.匀浆2min，加50ml氯仿，温和混匀后，50℃放置20min。4℃下10000rpm离心20分钟.水相部分加50ml经TLE平衡的酚,混匀后加50ml氯仿,混匀4℃下10000rpm离心15分钟,水相部分用加经TLE平衡的酚抽提直至无界面（一般3次）。水相部分氯仿抽提一次第43页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五3、实验步骤(续)水相部分加LiCl至2mol/L,4℃下沉淀过夜。4℃下10000rpm离心20分钟，用2mol/LLiCl冲洗沉淀用5ml水溶解，加LiCl至2mol/L，4℃下沉淀2小时以上。4℃下10000rpm离心20分钟，用2mol/LLiCl冲洗沉淀用2ml水溶解，加200ul3mol/LNaAC和5.5ml无水乙醇，-20℃下沉淀过夜4℃下10000rpm离心15分钟，用1ml水溶解。第44页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五异硫氰酸胍/酚法制备总RNA1.基本原理异硫氰酸胍(GIT)与β－巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性；GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl）作用使蛋白质变性，从而释放RNA；酸性条件下DNA极少发生解离，同蛋白质一起变性被离心下来，RNA则溶于上清中。该法所提RNA纯度高完整性好较适合纯化mRNA，逆转录及构建cDNA文库。与氯化铯方法比较，虽然纯度稍差一些，小分子RNA，如tRNA、snRNA不易去除，但产量高完整性好，盐易去除。

第45页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五2.试剂异硫氰酸胍溶液：4mol/L异硫氰酸胍（GIT），25mmol/L柠檬酸钠（pH7.0）,0.5%十二烷基肌氨酸钠（Sarcosyl）,0.1Mβ-巯基乙醇（用时再加0.36mL/50mL体系）.2mol/LNaAc（pH4.0）:用醋酸配，加少量水调pH。水饱和酚（pH3.5）氯仿/异戊醇（24：1）异丙醇(－20℃存放)DEPC-H2O（0.1%，V/V）

第46页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五3、实验步骤取2g左右植物组织放入研钵中，反复加入液氮充分研磨至粉末状。加4-5mL异硫氰酸胍溶液。转移到小离心管中，每管0.5mL。置于冰上，顺序加入：50μl2mol/LNaAc,混匀，0.5mL水饱和酚，170μl氯仿/异戊醇，混匀。置冰上15min。4℃,12000g离心20-30min。转移上清到另一管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12000g离心20min回收RNA。第47页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五3、实验步骤(续)用70％乙醇洗一次，4℃，12000g离心5min。吸去乙醇，空气中吹干RNA沉淀。用150μl异硫氰酸胍溶液，65℃吹打RNA沉淀溶解。加等体积异丙醇-20℃沉淀30min-1hr或-80℃沉淀10min。4℃,12000g离心20min回收RNA。用70％乙醇洗两次后，溶于适量的DEPC-H2O中。部分分装后进行纯度及完整性的检测。其余加2.5倍体积乙醇沉淀于-80℃冰箱中存放。紫外分光光度分析纯度和含量，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析完整性。第48页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五Trizol法制备总RNA

1.试剂Trizol试剂（含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等）75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

第49页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五2、实验步骤将组织在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mLTrizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。研磨液室温放置5min，然后以每1mLTrizol液加入0.2mL的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。12000g离心10min，取上层水相于一新的离心管，按每mLTrizol液加0.5mL异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10min，12000g离心10min。弃去上清液，按每mLTrizol液加入至少1mL的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5min。小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃助溶10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇中于-70℃保存。第50页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五附:总RNA纯化试剂盒1)．样品收集：称取200mg新鲜植物叶片，水冲净后用纸巾拭干，剪成碎片，立即浸入液氮，待冷冻完全后边加液氮边碾磨(防止样品融化)，直至组织被碾磨成粉末状。2）.样品匀浆：在粉末状植物组织中加入少量液氮，再加500ulR-A溶液，迅速碾磨至R-A溶液融化。将组织匀浆转入1.5ml离心管，如有较多组织匀浆残留在研钵中，加少量R-A溶液，适当匀浆后收集合并到1.5ml离心管.冰浴5min。4℃，在12000rpm下离心5min.吸取400ul上清转入另一1.5ml离心管中，测量匀浆体积(体积不足400ul时要加R-A溶液补足).第51页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五实验步骤（续）3)．加150ulR-E溶液，盖紧样品管，立即用力上下摇晃混合均匀。4).加450u1的4℃预冷的R-C溶液，盖紧样品管，立即用力上下摇晃混合均匀，冰浴5min；4℃下，12000rpm离心5min。注意:RNA和少量游离基因组DNA位于下相，蛋白质与基因组DNA复合物形成相间沉淀，残留的碎片沉淀于离心管底，脂质位于蓝色上相。5)．弃蓝色上相，取800ul下相转移至另一离心管中(注意:勿吸取界面和管底沉淀)。加560ul的R-D溶液，盖紧样品管，用力上下摇晃混合均匀，冰浴5min。6).4℃下，12000rpm离心10min将RNA沉淀于管底；注意:游离的基因组DNA位于下相，残留的蛋白质变性析出形成相间沉淀，RNA沉淀于离心管底。7)．倒置离心管,丢弃液相及界面沉淀。简短离心，仔细吸走残余液体。第52页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五实验步骤（续）

经此步骤纯化的总RNA纯度已满足诸如NorthernB1ot、RNA保护测定、体外翻译等多种RNA分析，而无需作进一步纯化(接步骤10）。仅当从富含RNA酶的细胞或组织中提取总RNA，或纯化用于RT-PCR分析的RNA样品，或怀疑RNA样品中仍含有少量基因组DNA污染时，才进行进一步纯化（接步骤8）。

8).加100ulbufferR-A溶液和100ulRNAse-freewater，充分溶解沉淀，混合均。9).加160ul异丙醇，混合均匀，4℃，12000rpm离心2min。10).弃上清，加500ul4℃预冷的无水乙醇，倒置离心管去液相，短暂离心。仔细吸去残液，空气中将乙醇挥发除去。11).加100ulbufferTE充分溶解RNA沉淀,40C，12000rpm离心10min，；；12).将上清转移到RNase-free的离心管中，置-80℃/-20℃保存待用。第53页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五IV、mRNA提取第54页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五一、概述制备mRNA原理

分离的总RNA可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点，用oligo(dT)纤维素柱分离，当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。然后经过两次oligo（dT）纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

第55页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五二、试剂2X上样缓冲液：40mmol/LTris.Cl,pH7.6;1.0Mol/LNaCl;2mmol/LEDTA,pH8.0;0.2%(m/V)十二烷基肌氨酸钠或SDS.洗脱缓冲液:10mmol/LTris.Cl,pH7.6;1mmol/LEDTA,pH8.0;0.05%SDS.第56页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五三、操作步骤用1ml0.1mol/LNaOH悬浮500mgoligo(dT)纤维素.将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，以3个柱体积的灭菌水冲洗柱床。用1X上样缓冲液冲洗柱床，知道流出液的pH值小于8.0。将提取的总RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2X上样缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1X上样缓冲液。测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2~3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。第57页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五三、操作步骤(续)加入1/10体积的3mol/LNaAC(pH5.2)、2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃放置30分钟。4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃中）。第58页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五附:RapidmRNAPurificationKit(AmrescoInc.)用rapidmRNAbindingbuffer

悬浮活化的oligo(dT)cellulose取100ul(最多25ug,1/5样品),在75℃下保温2min.悬浮活化的oligo(dT)cellulose加100ul的样品与20uloligo(dT)cellulose混合,冰上放置5min,每一分钟混匀一次.离心10秒钟(不要太长!)去上清,加200ulRapidmRNAwashbuffer,混匀.在沉淀前,离心10秒钟(不要太长!)重复步骤E.去上清,加无RNase的水20ul.混匀后在75℃下保温30秒钟在沉淀前,离心10秒钟(不要太长!),转上清液到一个新的离心管中.在沉淀中加20ul无RNase的水20ul.混匀后在75℃下保温30秒钟.在沉淀前,离心10秒钟(不要太长!)合并步骤H和步骤I得到的上清液.保存于-80℃冰箱.第59页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五V、琼脂糖凝胶电泳第60页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五(I)、DNA凝胶电泳

第61页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五一、概述

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的标准方法。

聚丙烯酰胺凝胶电泳主要分离小片段DNA(5-500bp),其分辨力极高，甚至可分开相差1bp的DNA片段。

琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。实验室中常规实验，一般用琼脂糖水平凝胶电泳装置进行DNA电泳。

第62页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五琼脂糖凝胶电泳仪聚丙烯酰胺凝胶电泳仪第63页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五二、琼脂糖凝胶电泳特性1．DNA分子大小：线性DNA分子在一定琼脂糖浓度内的迁移率与DNA分子量的对数成反比。2．琼脂糖浓度：小于0.5kb的DNA片段所需的凝胶浓度为1.2-1.5%;分离大于10kb的DNA片段所需的凝胶浓度为0.3-0.7%;DNA片段大小在两者之间的所需的凝胶浓度为0.8-1.0%。

分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度琼脂糖（%）分离DNA片段的有效范围（kb)0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-3

在0.5XTBE缓冲液中，溴酚兰相当于300bpDNA,二甲苯氰FF相当于4000bpDNA.第64页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五二、琼脂糖凝胶电泳特性3、DNA分子构象：对相同分子量的质粒DNA的三种构象，超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。4．电源电压：在低电压时，线性DNA片段的移动速率与所加电压成正比，但电压增高，不同分子量的DNA片段的移动速率将以不同幅度增加；片段越大，升高的幅度也越大。因此电压增高，琼脂糖有效分离范围将缩小。一般所加电压不得超过5V/cm.5．染料：溴化乙啶（EB），它可嵌入堆积的碱基对之间，在紫外灯下发荧光，检测DNA的下限可达1-10ng。注意：EB是强诱变剂！6、离子强度：在没有离子强度时，DNA几乎不移动，在高离子强度下，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。常见的电泳缓冲液为0.5xTBE及0.5xTAE,尤其前者更为常见。第65页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五第66页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五三、试剂：1、5TBE缓冲液：Tris.54g,硼酸27.5g,加入20ml

的0.5mol/LEDTA(pH8.0),定溶至1000ml.2、6上样缓冲液：0.25%溴酚兰,40%(w/v)蔗糖水溶液。3、溴化乙啶（EB）溶液母液：将EB配制成10mg/L，用铝箔或黑纸包裹容器，储于温室即可。4、DNA分子量标准：

DNA/EcoRI/HindIII:

DNA/EcoRI:21.2,7.4,5.8,5.6,4.9和2.5kb。

DNA/HindIII:23.1,9.4,6.6,4.4,2.3,2.0,0.56和0.12kb.第67页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五四、实验步骤1、稀释缓冲液的制备：用蒸馏水将5TBE缓冲液配制成0.5TBE稀释缓冲液.2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml三角烧瓶中，进入50ml的0.5TBE稀释缓冲液，放入微波炉或电炉加热至琼脂糖全部熔化，取出混匀。3、胶板的制备：将二端封闭的电泳槽置于水平支持物上，插上样品梳子。在冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入EB溶液至终浓度为0.5g/ml,即10mg/ml的母液加2.5ul，混匀。小心地倒入电泳槽中至一定高度。待胶液完全凝固后拔出梳子。然后向槽内加0.5TBE稀释缓冲液至液面刚好没过胶板表面。第68页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五四、实验步骤4、加样：取2-5l样品加1l的6上样缓冲液，用移液枪混匀（在Parafilm膜上操作），小心加到样品槽中。同时加DNA分子量标准对照。5、电泳：从负极到正极，60-80V,电流40mA以上。当溴酚兰条带移动至距凝胶前沿约2cm

时，停止电泳。6、观察和拍照：在波长为254nm的紫外灯下，观察DNA电泳带并估计其分子量大小。同时可用加红色滤光片和近摄镜片的相机拍照（光圈

5.6下暴光10-120秒）。第69页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五(II)、RNA凝胶电泳第70页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五一、概述

RNA分子有很多二级结构，需经变性剂处理，可以破坏RNA中的二级结构。然后，用琼脂糖凝胶电泳可分级分离不同大小的mRNA分子。常用的RNA琼脂糖凝胶电泳方法有三种:乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞琼变性电泳。第71页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五二、RNA甲醛变性电泳1、材料:5XMOPS电泳缓冲液：20.9gMOPS(0.1mol/L),pH7.0;8.3ml3mol/LNaAC(40mmol/L);10.0ml0.5mol/LEDTA(5mmol/L)pH8.0,用水定容至1L.以上药品和水均需用DEPC处理。10x甲醛上样缓冲液：1mmol/LEDTA,pH8.0;0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯蓝，50%甘油).37%甲醛（pH大于4.0，12.3mol/L）;甲酰胺;10mg/ml溴化乙锭.以上药品和水均需用DEPC处理。第72页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五2、实验步骤胶的制备：1.5g琼脂糖加115ml水，加热融化。冷却至60℃时加30ml的5XMOPS电泳缓冲液(终浓度为1X);加5ml甲醛（琼脂糖终浓度为1%）。制胶。样品制备：

RNA(最多30ug)5.5ul5XMOPS电泳缓冲液2.0ul

甲醛3.5ul

甲酰胺10ul

在65℃下处理15min,然后置冰上。加样品前，先用5v/cm电压电泳5分钟。制备好的样品短暂离心后加10X上样缓冲液2ul，混匀。上样。第73页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五2、实验步骤（续）在1XMOPS电泳缓冲液中电泳2-3小时。在电泳1-2小时后，可混合正负极缓冲液，再继续电泳。染色：将电泳好的胶板转移至含0.5ug/L溴化乙锭的0.1mmol/LNH4AC溶液中染色30-40min.（溴化乙锭也可以在电泳前加于样品中）注意：RNA大于1kb,用1%琼脂糖；RNA小于1kb,用1.4%琼脂糖。28SRNA分子量为6333；18SRNA分子量为2366.第74页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五三、RNA羟甲基汞变性电泳1、试剂：琼脂糖

羟基甲汞1ｘ羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳缓冲液（50mmol/L硼酸，5mmol/LNa2B4O7·H2O，10mmol/LNaSO4，pH8.1）2ｘ羟甲基汞凝胶上样缓冲液（1mol/L羟甲基汞25ul，4ｘ羟甲基汞凝胶电泳缓冲液500ul，甘油200ul，溴酚蓝2ug，H2O275ul）10mg/ml溴化乙锭10mol/L乙酸铵第75页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五２、实验步骤将1%（RNA>1kb）或1.4%(RNA<1kb)的琼脂糖溶于1x羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳缓冲液中，待溶液冷却至55℃时加入羟甲基汞至终浓度为5mmol/L.将RNA溶液与2×凝胶上样缓冲液等体积混合(每个0.6cm标准样品槽可加10ugRNA),上样．在5~6V/cm下电泳12~16小时.电泳结束后,RNA可在含0.5ug/ml溴化乙锭的0.1mol/L乙酸铵溶液中染色30~45分钟，然后在紫外灯下检查.第76页，共89页，2022年，5月20日，1点45分，星期五3.注意事项