植物细胞工程

9/9植物细胞工程HUAZHONGAGRICULTURAL

UNIVERSITY

烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究ResearchonCallusInductionandPlant

RegenerationofTobaccoLeaves

姓名:黄金波

CANDIDATE：Huang-JinBo

学号:2012304200510

STUDENTID：2012304200510

课程:植物细胞工程实验CURRICULUM：PlantCellEngineeringExperiment

班级:MAJOR:生技1201班Biotechnology1201

指导老师：SUPERVISOR：柳俊齐迎春陈浩

Liu-JunQi-YingChunChen-Hao

中国武汉

WUHAN，

CHINA

二○一四年十二月DEC,2014

烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的研究

黄金波

华中农业大学生命科学技术学院生技1201班

[

darkcondition;Buddifferentiationstatushavecertaindifferenceindarkandlightconditions,differentiationofplantseedlingsininducedtherewasnosignificantdifferencebetweenlightanddarkconditions.[Conclusion]theilluminationconditionandundertheconditionofdarkinductioncanaffectthebuddifferentiationofcallusbudnumberandstatus.

[KeyWords]TobaccoLeaves；Callus；CellEngineeringDifferentiation；Induce；

PlantRegeneration

1.前言

细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学、遗传学、发育生物学等学科的原理和方法，通过某种工程学的手段，在细胞水平或细胞器水平上，按照人们的意愿对细胞进行改造，从而得到目的产物的一门综合科学技术（柳俊等，2011）。近年来，由于包括遗传学、分子生物学、生理学、工程学、生物物理学等学科的快速发展和融合，细胞工程再综合了各大学科的优势以及利用自身的特点后，也得到了极大的发展。

细胞工程技术根据对象分类，可以将其分为植物细胞工程、动物细胞工程和微生物细胞工程。它们之间的原理和方法都是相通的，但是又有微小的区别。植物细胞工程技术的发展源头可以追溯到上世纪初，发展到现在，其实它的应用已经非常的广泛。目前来说，它已被广泛用于医学、能源、制药、农业育种、食品等方面的科学研究和生产应用。下面就主要对动物细胞工程和植物细胞工程技术在生产生活中的一些应用做一些简单的介绍。

1.1动物细胞工程技术及其应用

动物细胞工程主要是应用细胞生物学和工程学的研究手段和原理，通过细胞培养、细胞融合、细胞核移植、胚胎移植、基因转移等技术而发展起来的一门生物技术（叶敏，1984）。目前在细胞工程制药、细胞治疗、干细胞培养、细胞核移植等方面有着非常广泛的应用（李刚等，2002；唐红等，2011；马瑞丽，2007；）。下面就以下几个方面对动物细胞工程技术的一些应用做一些简单的介绍。1.1.1生产单克隆抗体和细胞因子

自1975年英国剑桥大学的科学家利用

动物细胞融合技术首次获得单克隆抗体以来，现在针对各种抗原的单克隆抗体已被广泛应用于生命科学的各个领域，而细胞工程技术的发展对于单克隆抗体的生产无疑是

提供了强大的技术支持。用单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异，尤其在鉴别菌种型及亚型、病毒的变异株以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具

独特优势。这些都是传统血清法或动物免疫法所做不到的，而且利用细胞工程技术生产的单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强的特点，所以诊断非常准确，误诊率与传统血

清学手段相比大大降低（唐红，2011）。

不仅如此，近年来的发展也将细胞工程带入了肿瘤诊断的领域，利用生产的特异性单克隆抗体为肿瘤的检测和治疗提供了新

的思路和方法。比如就有这样的报道，有科学家利用单克隆抗体耦联放射性核素，在肿瘤局部产生足够的电离辐射生物学效应，这在治疗卵巢癌的实验与临床研究已取得较

大进展，给卵巢癌特别是术后复发及化疗耐药患者的治疗带来新的希望（吴嘉涵，2009）。

1.1.2细胞融合技术

细胞融合指在诱导剂或促融剂作用下，两个或两个以上的异源细胞或原生质体相

互接触，进而发融合并形成杂种细胞的现象。细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技

术之一，不仅在农业、工业的应用领域不断扩大，而且在医药领域也取得了开创性的研究成果。这其中其实也主要包括有单克隆技

术（马瑞丽，2007）。但是，不仅是单克隆技术，细胞核移植技术也得到了很好的发展。自从1997年克隆羊多利诞生以来，相继在很多国家都报道出来已经克隆出各种动物，比如说我国的克隆牛、克隆猪、克隆鼠等。

克隆动物的技术最大的发展前景莫过

于将它与转基因生物反应器结合起来，发展为类似于动物工厂的优势杂种细胞用于生

产各种药物。这其中比较成熟的比如有利用转基因动物乳腺作为生物反应器,生产基因

工程人类蛋白质药物，它可以使成本较微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物大大降低（李刚等，2002）。

1.2植物细胞工程技术及其应用

植物细胞工程是以细胞的全能性和体

细胞分裂的均等性作为理论依据，在细胞水平上对植物进行操作的育种新技术。植物细胞工程包括染色体工程技术、原生质体培养、花药培养、细胞培养与无性系筛选、组织培养与体系胞杂交、器官与胚胎培养、植物脱毒快速繁殖与人工种子生产技术等（李培夫等，2006）。

植物细胞工程技术目前应用十分广泛，其中在作物育种方面的应用报道的最多。下面做些简单的介绍。

1.2.1在植物作物育种中的应用

我们知道，传统的杂交育种在自交5代

以后可以产生一些同质配子结合的纯合植株，需要经6-8代才可选育出新品系。对于

一年一季的植物，这之间需要花费最少5-8

年的时间，甚至更久。而单倍体育种是通过单倍体培养迅速获得纯合二倍体，从而大大缩短了育种年限，有些单倍体育种只需要两年左右的时间就可以得到纯种，为育种提供了极大的方便，而且选出的品种纯种率高（柳成荫，2011；李培夫等，2006）。

目前我国在植物育种中的应用在很多

方面都有建树。比如说在水稻育种、菊花育种、茶树育种、枣树育种等等都有比较深入的研究（王婷婷，2009；白瑞霞,2007;邝琦,2010;邱涛涛,2010）。

1.2.2在农业生产中的应用

在农业生产方面，目前，根据人们的需要已经相继完善和发展了一些具有特色的

植物细胞工程实用技术，包括植物细胞组织培养技术、无性快繁技术及单倍体育种技术等，这些技术在脱毒苗生产、经济植物快繁、植物新品种选育及有用次生代谢产物生产

方面发挥了重要作用。

植物细胞工程在脱毒苗生产方面的应

用主要是想提高农产品的产量和质量。目前主要采用的方法和手段是茎尖剥离的方法。这在我国都已经得到了很大的推广。我国相继在黑龙江、内蒙古、湖南、湖北、河南和甘肃等地建立了生产脱毒种薯的原种场，目前，草莓、苹果、柑橘和葡萄等经济植物都已建立了脱毒苗生产技术（柳成荫，2011）。在其他方面，植物细胞工程在经济植物快繁方面的应用的技术也十分成熟。例如利用植物快繁技术可以使生根困难的名贵花卉大

量繁殖，还可应用于杂合植物材料的快速繁殖，因为很多优良的观赏植物和经济植物都是杂种，一旦有性繁殖，其后代性状会发生分离。而通过无性繁殖则能够保持其杂合性，并可以大量生产性状均一的商品苗。目前已在木薯、马铃薯、咖啡、橡胶、菠萝、甘蔗和苹果等经济植物上建立了植物快繁技术（杨贺，2010）。

1.2.3培养生产次生代谢物

植物细胞培养作为一种有效生产有重

要价值次生代谢物的技术.与其他方法相比,应用植物细胞培养技术生产次生代谢

产物具有以下优点:

(1)有利于研究植物的代谢途径,还

可以利用某些基因工程手段探索与创造新

的合成路线,得到价值更高的产品；

(2)所获得产物可从培养体系内直接

提取,快速、高效的回收与利用,简化了分

离与纯化步骤；

(3)节省大量用于种植原料的土地,

以便土地资源得到高效利用；

(4)能够减少各种环境因素对产物的

影响,确保在一个限定的生产系统中连续、均匀生产；

(5)有利于细胞筛选、生物转化，合成新的有效成分；

(6)可以在生物反应器中进行大规模培养,并通过控制环境条件提高代谢物产量。

目前植物细胞工程技术应用于生产次

生代谢的产物有植物生长过程中产生的一

些酚类、萜类、含氮化合物（罗凯，2007；谷荣辉等，2013）。这其中很多对于我们有着非常重要的商业价值和药用价值。例如，一些重要的植物代谢产物具有抗癌防癌的

药用功效；我国通过细胞培养已经用于商业化生产的次生代谢物主要有小檗碱、紫杉醇等,具有很好的抗癌、抑菌消炎活性(张玲华，2006)。除了药用外,许多次生代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料,如用作杀虫剂、染料、调味品和香料等。

总之,次生代谢物不仅是植物生命活

动不可或缺的物质,而且对人类社会的生

存发展也起着重要的作用。

1.3本次实验的目的及意义

1.3.1实验目的

通过实验课程，掌握细胞工程的核心技术无菌操作技术和植物个体再生技术；通过实验课程和理论课程的学习，了解特殊器官离体发生调控技术；最后，通过整个过程，能够初步掌握本领域的实验设计、结果分析及其报告/论文的撰写。

1.3.2实验意义

随着各个学科之间的深入融合和快速发展，细胞工程技术也得到了极大的发展，尽管动物细胞工程与植物细胞工程在技术和原理上都存在一定的差异，但其核心技术和原理是相通的，都是利用无菌操作技术和细胞的全能性等。所以通过植物细胞工程实验课程，可以让我们对于细胞工程技术有较为深入的了解和掌握，可以使我们学习到相关关键的操作技术。同时，在整个细胞工程实验过程中，我们还学习到了一些其他的技术，比如制作试管花卉、人工种子等，转基因水稻gus报告基因的瞬时表达和检测等等这些实验，使我们对其中一些的实验非常感兴趣。总之，本次实验既让我们学习到了相关的技术和原理，还激起了我们对其中的一些实验极大兴趣。

2.实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1材料：无菌烟草苗

2.1.2培养基

诱导培养基：MS培养基+0.25mg/LNAA+0.25mg/LBA+8g/L琼脂

分化培养基：MS培养基+0.25mg/LNAA+1.0mg/LBA+8g/L琼脂

2.1.3其他器材与试剂

器材：天平、电磁炉、烧杯、移液管、三角瓶、灭菌锅、超净工作台、恒温（25℃）培养室等

试剂：蔗糖、琼脂、MS培养基母液等

2.2实验方法

2.2.1无菌苗的培养（老师准备）

2.2.2培养基的配置

按配方加入各培养基成份。

i.取一大的容量瓶，配制1000ml培养基母液备用。1000ml容量瓶中顺序加入已配好的培养基母液（齐迎春等，2014）：大量元素25ml，微量元素5ml，铁盐5ml，维生素5ml，肌醇5ml，甘氨酸5ml；其中，诱导培

养基中再加入0.25mg/LNAA、0.25mg/LBA；分化培养基中加入0.25mg/LNAA、1.0mg/LBA。

ii．加好后，加水至总体积的3/4左右，加入20g蔗糖搅拌使溶化，用0.5N的NaOH和0.5N的HCl调整pH至5.8-6.0。

iii.加入8g琼脂，置于电磁路炉上加热，搅拌使琼脂完全溶化，再用蒸馏水定容至终体积1000ml；继续加热几分钟使充分混均，分装于三角瓶中，每瓶20ml左右；用记号笔表明培养基类型。

iv.灭菌（老师准备）。将分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件：温度121℃，压力1.1kg/cm2，时间20min。灭菌后的培养基置于无菌室保存备用。

2.2.3愈伤组织的诱导培养

将烟草叶片用剪刀剪成1cm2大小的小立方块，接种于已灭菌含诱导培养基的三角瓶中。每个三角瓶接种4-6片，注意不要太多；另外，在选取叶片时尽量不要选取叶片的顶芽和芽尖，因为顶芽和芽尖的生长素浓度较高，不利于叶片的诱导；并且，将小叶片的四边都剪一下，以使叶片充分接触培养基。全程都在超净工作台中进行，严格控制无菌操作。

每人接种六个三角瓶，三个放于光照条件（实际为每天十二小时光照）下培养，另外三个置于黑暗条件（全天黑暗）下培养。培养三周。

2.2.4器官的分化培养

在诱导培养基中培养三周后，取出，将污染的材料废弃，将没有污染的材料接种到含分化培养基的三角瓶中，原则上是将原来一个三角瓶中材料转移到对应的一个含分化培养基的三角瓶中。因为光照条件下和黑暗条件下各有两瓶被污染了，而剩下的材料每个三角瓶又长得太多，所以将剩下的光照条件下的材料转移到了两个分化三角瓶中，将黑暗条件下的材料转移到了三个分化三角瓶中。做好光照诱导和黑暗诱导的标记，置于光照下培养两个月左右，观察结果。

3.实验结果与分析

3.1实验结果统计

3.1.1烟草叶片诱导结果统计

烟草叶片诱导成愈伤组织统计表

Statisticforcallusinductionoftobaccoleaves

编号Number

接种数

Inoculation

number

愈伤组织形成数

Callusnumber

诱导率

Induction

rate

是否污染

Pollution

愈伤组织生长状态

Growthstateofcallus

L16583.33%是被污染，没形成愈伤组织

L255100.00%是被污染，但均形成愈伤组织，2个

长根

L366100.00%否均长根，形成愈伤组织

D15240.00%是被污染，有一个愈伤组织，且长根D2500.00%是被污染，无愈伤组织形成

D355100.00%否2个长根，4个形成愈伤，1个没

长

3.1.2烟草叶片分化结果统计

烟草叶片愈伤组织植株再生情况统计表

Statisticforcallusdifferentiationandregenerationoftobaccoleaves

编号Number愈伤组

织来源

Source

of

callus

分化率

Differentiation

rate

愈伤分

化芽数

Number

of

sprout

分化芽状态

Stateofsprout

愈伤植

株数

Number

of

callus

plant

株苗状

态

State

of

plant

污染率

Pollution

是否有

芽

Is

there

大小

Size

密集程度

Density

L1-1光照100%23有+++++++++1+0L1-2光照100%18有+++++++++3+0L1-3光照100%27有++++2+0L1-4光照100%34有+++++++++0o0L2-1光照100%78有++++++8+++0L2-2光照100%26有+++++3++++0D1-1黑暗100%13有++2++++0D1-2黑暗100%12有+++++3++++0D1-3黑暗100%16有+++++3++0D2-1黑暗100%12有+++++3++++0D2-2黑暗100%25有++++++2++0D2-3黑暗100%11有+++++1+++++0D3-1黑暗100%7有+++++1++0D3-2黑暗100%16有+++++7++++0D3-3黑暗100%9有++++2++0D3-4黑暗100%12有++++++++0o0说明：i.L表示光照条件下诱导，D表示在黑暗条件下诱导。

ii.对于分化芽状态，在大小一栏，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分别表示小、较小、适中、较大、

大；在是否密集一栏，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分别表示稀疏、较稀疏、适中、较密集、密

集。对于株苗状态，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”分别表示短小、较短小、适中、较大、大；o

表示无。

Note：i.Lmeansinducedundertheconditionoflight；Dmeansinducedundertheconditionofdark；

ii.Forthestateofsprout，inthesizecolumn，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”standforsmall、lesssmall、

moderate、lesslarge、large，respectively；inthedensitycolumn，“+”、“++”、“+++”、“++++”、“+++++”stand

forsparsity、lesssparsity、moderate、lessdenseness、densenessrespectively。TotheStateofplant，“+”、“++”、

“+++”、“++++”、“+++++”standforsmall、lesssmall、moderate、lesslarge、large；omeansnoplant。

3.2结果分析

对烟草叶片愈伤组织分化再生进行统计分析，以对比光照和黑暗条件下诱导对于植株再生的影响，整理出以下结果。

3.2.1对分化率的影响

由统计分析可知，不管是在光照条件还是在黑暗条件下诱导，最终分化率都达到了100%，所以光照条件和黑暗条件对于愈伤组织分化率没有影响。

3.2.2对愈伤组织分化芽数的影响

由统计数据可知，在光照条件下诱导总计分化芽数为206颗，在黑暗条件下诱导分化芽数为133颗，平均每个愈伤组织分别诱导出的芽数为34.33颗和13.30颗，经方差分析可得：

光照和黑暗对愈伤组织分化芽数的影响方差分析

差异源SSdfMSFP-valueFcrit行1140.7511140.757.6380.039666.607891列1817.4175363.48332.4340.1756445.050329误差746.755149.35

总计3704.91711

根据方差分析可以得到P值小于0.05，所以在光照条件和在黑暗条件下诱导对愈伤组织分化芽数的影响达到了显著差异，在光照条件下诱导比在黑暗条件下诱导更有利于愈伤组织长芽。

3.2.3对分化芽状态的影响

对于分化芽状态，不管是在光照条件下还是在黑暗条件下诱导都不影响分化出芽，均能达到100%；对于分化芽的大小，同样可以做方差分析，可以得到光照和黑暗条件下诱导对分化芽的大小没有明显区别；对分化芽的密集程度进行分析，结果显示在黑暗条件下分化芽趋向密集生长，在光照条件下诱导相对长得更稀疏。

3.2.4对形成植株的影响

由统计表进行方差分析可以得到光照条件下诱导和黑暗条件下诱导对形成植株数以及对于株苗形成的状态均没有显著的影响。

3.3实验结果分析与讨论

在诱导培养实验中，结果有66.7%的材料被污染了，分析其原因有一下几点：①操作不规范，在操作过程中没有严格地按照无菌