凯里市大气降尘中可培养微生物群落结构分析研究

凯里市大气降尘中可培养微生物群落结构分析研究摘要：为了探究空气质量指数较好区域大气沉降中微生物组成及多样性，以凯里市为代表，通过采集凯里城区、炉山工业区、清水江畔3个典型区域大气降尘颗粒物，采用细菌可培养法、梯度稀释计数法及16SrRNA基因分子鉴定方法对凯里市大气降尘颗粒物中可培养细菌进行群落结构多样性与丰度分析.结果分离得到119株，经分类学鉴定为25属，优势类群为芽抱杆菌、节杆菌及考克氏菌属；城区样品中微生物浓度最高，但是清水江畔样品中微生物种类数量最多.研究结果对认识凯里市大气颗粒物中微生物组分及其多样性具有一定参考价值.关键词：大气沉降；16SrRNA基因；可培养细菌；凯里市0前言大气降尘是大气颗粒物的重要组分之一，粒径多在10Jim到100pum之间，主要通过降水的方式并在重力作用下自然沉降于地面或沉积在地球表层⑴.大气降尘来源复杂，可分为人为来源和自然来源，例如，工厂加工过程中产生的工业粉尘、煤尘、地面扬尘、建筑灰尘以及生物界中的花粉、土壤颗粒物及在自然环境中新生成的矿物等⑵大气降尘对生态环境质量和人体健康具有重要影响，而且它与人体健康效应各终点的流行病学有着密切联系[3-4].大气降尘在降水和重力作用下，沉降到土壤、地表水等介质中改变土壤的性质，加大水源污染;城市与工业区生产排放出的污染物还能以扬尘或降尘的形势释放到大气环境中，降低空气质量；大气沉降携带的细菌还可以通过呼吸、饮食等方式进入人体,给人体健康带来危害[5-6].当前对大气降尘的研究主要集中在大气降尘的理化性质、传输机制、时空分布、环境效应等方面，对其生物组分特性了解较少凯里作为全国优秀旅游城市，环境空气质量优良天数常年名列前茅.随着一系列大气污染物控制措施及各种相关政策落实，颗粒物现已成为城区的首要污染物.本研究主要通过收集典型的城区（凯里市中心）、工业区（炉山工业园）、清水江边降尘颗粒物样品，分析凯里市大气降尘颗粒物中的微生物组成、浓度及分布特征，在此基础上,通过比对致病菌株数据库分析大气降尘颗粒物中的病原微生物组分，为该地区环境治理及环境质量评价提供数据支撑.1材料与方法降尘颗粒物的采集大气降尘微生物群落组成并不稳定，很容易受到周围各种环境因素和其他因素的影响，导致其微生物群落发生改变，特别是气候因素，基于上述考虑,本研究选择在3月初，微风时期进行样品采集.根据降尘颗粒物的不同来源进行分区采集样品，采样高度距地面1~2m,采集的位置主要包括公路边的电线杆、公交站台、建筑楼以及窗台.用毛笔刷将不同位置采集到的降尘通过滤纸扫到灭菌好的玻璃瓶中，由于受到实验条件和经费的限制，将该地区采集的样品进行混合鉴定.对城区、工业园区和清水江畔3区域选取采样点信息如下所述.1.4.2PCR扩增检测及测序凯里市城区各街道均有人流量大、交通密集、大型建筑多的特点.根据其交通、人群、植物、食品、建筑、绿化等情况，随机选择5个采样点，分别是西门中学(26°35'21"N,107°58'19”E)、凯运司(26°35'10"N,107。58'41"E)、苹果山(26°35'11"N,107°58'44"E)、州医院(26°34'59"N，107°58'31"E)和体育馆(26°34'14"N，107°58'26"E)采样点.工业园区的道路旁(26°38'35"N，107°46'40"E)、重工业区(26°38'26"N，107°46'42"E)和广场(26°38'35"N，107°46'25"E)3个区域.清水江畔(下司至镰刀湾段)有下司(26°31'3”N,17°48'30"E)、镰刀湾(26°31'38"N，107°52'47"E).1.2LB培养基LB培养基组成如下:蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl10,琼脂20,调整pH为7.2,并加入去离子水定容至1L.1.3降尘细菌培养、分离与计数将城区、工业园区和清水江畔采集到的降尘样品各称取1g,置于无菌玻璃瓶中，然后加入5mL的无菌水放入摇床均匀振荡30min后再静置20min.在超净工作台，经适度梯度稀释后(100、10-'、10-2，、“・、10-7)后，取稀释液200讪涂布平板，然后置于30t恒温培养箱中倒置培养24~48h,观察培养皿中不同浓度微生物的生长情况，选取菌落数量在30~300个的平板进行菌落计数，并根据公式a*5/10-(a:菌落个数;n:稀释梯度)计算样品中细菌浓度(CFU/g).所有实验设置3重复，尽量减少随机误差造成的影响.1.416SrRNA基因测序进行微生物分类鉴定菌落PCR扩增16SrRNA基因DNA模板制备：用牙签从培养后的平板上随机挑取菌落加入到装有50讪无菌水的1.5mL离心管中，然后采用热激冷冻方法,进行细胞破碎,使细菌DNA分子破裂释放出水溶液中.具体操作如下：将离心管先放入100t水浴锅中加热5min,立即转移至冰水混合物中冰浴5min,重复上述过程2次，最后12000r/min离心2min后备用.50pXPCR扩增体系：2xTaqMasterMix(大连宝生物公司)25pL,10pM27F引物1pL,10pM1492R引物1pL,DNA模版2pL,ddH2O补足21pL.PCR扩增程序：预变性98t2min；29个循环(变性94210s，退火45210s，延伸72t1.5min)；72t5min；降温2525min；42保存.PCR产物使用1%(M/V)琼脂糖凝胶电泳进行分析，然后送至赛默飞世尔科技(中国)有限公司(广州)进行纯化及16SrRNA基因测序.1.4.3序列分析将测序结果批量提交至美国国立生物信息技术与中心(NationalCenterofBiotechnologyInformation,NCBI)16SrRNA基因数据库进行BLASTN(/Blast.cgi)比对分析,并以同源性最高序列(总分最高)作为参照菌株，确定所分析菌落的分类关系.1.5致病菌株分析根据报道的致病菌株数据库[8],确定致病菌类别.2结果与分析降尘颗粒物中可培养细菌浓度经过LB培养基按浓度梯度培养后,观察降尘颗粒物菌落培养皿中不同梯度稀释度涂布平板的生长情况，选取平板中菌株数在30~300的培养皿进行菌落计数,然后对多次计算结果平均值随机计数菌落数量得出3个区域样品中可培养微生物浓度从高到低分别为:城区3.7X107CFU/g，清水江畔3.3x106CFU/g,工业区8.5x105CFU/g.城区作为黔东南州中心，人口相对于后两者密集，交通流量大,初步推断,该区域的降尘颗粒物浓度受人类活动影响较大.沉降微生物种类随机挑取182个菌株(其中城区样品62个、工业园区样品60个、清水江畔60个)进行16SrRNA基因分析，并将获得的119个阳性PCR产物(其中城区样品40个、工业园区样品37个、清水江畔42个)进行测序.以BLAST比对结果最高得分和最大相似度来确定该细菌的属名，结果如表1所示.从凯里市区沉降中鉴定到的细菌包括芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、考克氏菌属(Kocuria)和两面神菌属(janibacter)等12种菌属，其中芽孢杆菌属(22.5%)和节杆菌属(17.5%)为主要优势菌属(图1);从炉山工业园区分离到马赛菌属(Massilia)、弗里戈里氏菌属(Friedrichia)、冰冻小杆菌属(Frigoribacterium)和副球菌属(Paracoc-CUS)等5个属，其中马赛菌属为优势菌占，比例高达86.5%(图1);从清水江畔区域降尘颗粒物中鉴定到微杆菌属(Microbacterium)、芽孢杆菌和考克氏菌属等15个属菌株，其中微杆菌属占42.85%，为主要优势菌属(图1).克隆编号。参考菌株最大得分覆盖度/%期望值相似度注册号S-3Bacillusonubensis0911MAR22V3169799099.68NR_149252.1S-4Bacillusonubensis0911MAR22V31701100099.79NR_149252.1S-5Bacillusonubensis0911MAR22V31706100099.89NR_149252.1S-6Bacillusonubensis0911MAR22V3170699099.89NR_149252.1S-7Bacillusonubensis0911MAR22V3163499098.53NR_149252.1S-8Bacillusonubensis0911M.AR22V31710990100NR_149252.1S-10KocuriapolarisCMS76or167499099.37NR_028924.1S-11MicrobacteriumfoliorumP333/02165399098.94NR_025368.1S-13KocuriasediminisFCS-11165598099.26NR_118222.1S-14KocuriaroseaDSM20447167499099.37NR_044871.1S-16LuteococcussanguinisCCUG338971629950100NR_025507.1S-17CorynebacteriumcallunaeNCIMB10338169099099.68NR_037036.1S-19KocuriaroseaDSM20447169999099.68NR_044871.1S-20NeomicrococcuslactisDW1521685980100NR_117033.1S-21CurtobacteriumoceanosedimentumATCC31317164199098.42NR_104839.1S-22JanibactermelonisCM2104168299099.37NR_025805.1S-23JanibactermelonisCM2104168299099.37NR_025805.1S-24ModestobacterroseusKLBMP1279168099099.37NR_109643.1S-27CurtobacteriumoceanosedimentumATCC31317169199099.68NR_104839.1S-28MicrobacteriumfoliorumP333/02166699099.26NR_025368.1S-29MicrobacteriumfoliorumP333/02166198099.26NR_025368.1S-30KocuriaroseaDSM20447168699099.68NR_044871.1S-31ArthrobactertectiLMG22282166799099.15NR_042251.1S-32ArthrobacteragilisDSM20550167799099.26NR_026198.1S-33JanibactermelonisCM2104169299099.58NR_025805.1S-34NeomicrococcuslactisDW1521687980100NR_117033.1S-35Bacillustimonensis10403023164699098.42NR_133024.1S-36BrachybacteriumconglomeratumJ1015170199099.79NR_104689.1S-37ModestobacterroseusKLBMP1279151299095.7NR_109643.1S-38NeomicrococcuslactisDW1521685980100NR_117033.1S-40ModestobacterroseusKLBMP1279166799099.15NR_109643.1S-47JanibactermelonisCM2104167999099.47NR_025805.1S-50ArthrobactertectiLMG22282166299099.15NR_042251.1S-51ArthrobactertectiLMG22282164599098.73NR_042251.1S-52ArthrobactertectiLMG22282166999099.16NR_042251.1S-53ArthrobactertectiLMG22282166499099.05NR_042251.1S-54ArthrobactertectiLMG22282167499099.16NR_042251.1S-55KnoelliaflavaTL1167899099.37NR_117982.1S-56Bacillusonubensis0911MAR22V3170699099.89NR_149252.1

S-58Bacillusonubensis0911MAR22V3170699099.89NR_149252.1G-1ParacoccuscarotinifaciensE-396170099099.79NR_024658.1G-2MassiliaaureaA58NR_042502.1G-4Frigoribacteriumfaeni801165799099.05NR_026511.1G-5Frigoribacteriumfaeni801166499099.26NR_026511.1G-7MassiliaaureaA47NR_042502.1G-8MassiliaaureaA78NR_042502.1G-9BrevundimonasvesicularisNBRC12165169999099.89NR_113586.1G-10MassiliaaureaA47NR_042502.1G-13MassiliaaureaA79NR_042502.1G-15MassiliaaureaA68NR_042502.1G-16MassiliaaureaA68NR_042502.1G-18NovosphingobiumbarchaimiiLL02167898099.79NR_118314.1G-19MassiliaaureaA16NR_042502.1G-20MassiliaaureaA36NR_042502.1G-22MassiliaaureaA79NR_042502.1G-23MassiliaaureaA89NR_042502.1G-24MassiliaaureaA37NR_042502.1G-25MassiliaaureaA68NR_042502.1G-26MassiliaaureaA68NR_042502.1G-27MassiliaaureaAP131699100099.68NR_042502.1G-33MassiliaaureaAP131703100099.79NR_042502.1G-42MassiliaaureaA89NR_042502.1G-43MassiliaaureaAP131708100099.89NR_042502.1G-45MassiliaaureaAP131708100099.89NR_042502.1G-46MassiliaaureaAP131708100099.89NR_042502.1G-47MassiliaaureaA79NR_042502.1G-49MassiliaaureaA79NR_042502.1G-50MassiliaaureaA68NR_042502.1G-51MassiliaaureaA89NR_042502.1G-53MassiliaaureaA89NR_042502.1G-54MassiliaaureaA89NR_042502.1G-55MassiliaaureaA79NR_042502.1G-56MassiliaaureaA79NR_042502.1G-57MassiliaaureaA68NR_042502.1G-58MassiliaaureaA68NR_042502.1G-59MassiliaaureaAP131708100099.89NR_042502.1G-60MassiliaaureaA68NR_042502.1Q-1ExiguobacteriumacetylicumDSM20416170699099.89NR_043479.1Q-2PseudomonascoleopterorumEsc2Am168799099.58NR_137215.1Q-4BacillusmarisflaviTF-11170199099.79NR_118437.1Q-5MicrobacteriumtestaceumDSM20166168799099.58NR_026163.1Q-7BacillusbadiusNBRC15713170899099.89NR_112633.1

Q-8BrachybacteriumparaconglomeratumLMG19861170599099.79NR025502.1Q-9MicrobacteriumtestaceumDSM201661714990100NR026163.1Q-10PsychrobactermaritimusPi2-20171599099.9NR027225.1Q-11ArthrobacterpascensDSM20545129799090.85NR026191.1Q-12MicrobacteriumtestaceumDSM20166170399099.79NR026163.1Q-13SanguibacterinulinusST50169299099.58NR029277.1Q-15PsychrobacterpulmonisCCUG462401718990100NR118026.1Q-16StaphylococcusequorumPA231169598099.89NR027520.1Q-18MicrobacteriumoryzaeMB10169198099.89NR117527.1Q-19MicrobacteriumhalotoleransYIM70130163099098.21NR036935.1Q-20BacillusfirmusNBRC153061702100099.69NR112635.1Q-22MicrobacteriumtestaceumDSM20166170599099.79NR026163.1Q-23PlanococcuscitreusNBRC15849171399099.9NR113814.1Q-24MicrobacteriumtestaceumDSM20166170399099.79NR026163.1Q-25MicrobacteriumtestaceumDSM201661707100099.79NR026163.1Q-26MicrobacteriumtestaceumDSM201661715100099.9NR026163.1Q-27StreptomyceslitmocidiniNRRLB-3635169399099.68NR116096.1Q-33MicrobacteriumtestaceumDSM20166168899099.68NR026163.1Q-37MicrobacteriumtestaceumDSM20166177899099.7NR026163.1Q-41StreptomyceslitmocidiniNRRLB-3635169199099.68NR116096.1Q-42PlanococcuscitreusNBRC15849169198099.89NR113814.1Q-44MicrobacteriumtestaceumDSM20166170199099.79NR026163.1Q-45MicrobacteriumhydrocarbonoxydansBNP48169799099.68NR042263.1Q-46KocuriaroseaDSM204471714100099.79NR044871.1Q-48StaphylococcuschromogenesCBCC1462170199099.79NR036901.1Q-49MicrobacteriumradioduransGIMN1.002169799099.68NR117294.1Q-51BrevibacteriumsediminisCGMCC1.15472169599099.58NR153678.1Q-52MicrobacteriumtestaceumDSM20166169699099.79NR_026163.1Q-53MicrobacteriumtestaceumDSM201661707100099.79NR_026163.1Q-54KocuriaroseaDSM204471698100099.58NR_044871.1Q-55MicrobacteriumtestaceumDSM20166170899099.89NR_026163.1Q-56KocuriaroseaDSM20447169399099.68NR_044871.1Q-57MicrobacteriumtestaceumDSM20166168698099.68NR_026163.1Q-59BacillusparamycoidesMCCC1A0409877297079.01NR_157734.1Q-60PseudarthrobacterpolychromogenesDSM20136170499099.89NR_026192.1Q-61BrevundimonasbullataNBRC13290170799099.79NR_113611.1Q-62KocuriaroseaDS