基因工程导论课件

基因工程曹永长教授华南农业大学动物科学学院基因工程曹永长教授生物技术生物技术(Biotechnology)是一门新兴的综合的学科,有时也称生物工程(Bioengineering)，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他学科的技术原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。生物技术生物技术(Biotechnology)是一门生物技术的种类1、基因工程(geneengineering)2、细胞工程(cellengineering)3、酶工程(enzymeengineering)4、发酵工程(fermentationengineering)5、蛋白质工程(proteinengineering)生物技术的种类1、基因工程(geneengineerin五大技术之间的关系基因工程微生物发酵工程工程菌蛋白质或酶动植物个体或细胞产品细胞工程蛋白质工程或酶工程优良动植物品系五大技术之间的关系基因工程微生物发酵工程工程菌蛋白质或酶动植基因工程应用人工方法把生物的遗传物质(DNA)分离出来,在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体,从而改变它们的遗传品性;有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物(多肽或蛋白质)。这种创造新生物并给予新生物以特殊功能的过程就称为基因工程,又叫DNA重组技术。基因克隆（genecloning），DNA克隆（DNAcloning），分子克隆（molecularcloning)，基因工程（geneengineering），遗传工程（geneticengineering）等术语常与重组DNA技术通用。基因工程应用人工方法把生物的遗传物质(DNA)分离出来,在体基因工程理论依据1、不同基因具有相同的物质基础。2、基因是可以切割的。3、基因是可以转移的。4、多肽与基因之间存在对应关系。5、遗传密码是通用的。6、基因是可以遗传的。基因工程理论依据1、不同基因具有相同的物质基础。遗传物质——DNA遗传物质——DNA在每轮DNA复制过程中，DNA分子的每条链均被用作合成其互补链的模板。因此，经过多代复制之后，其遗传信息仍然保持完整。

DNA复制是“半保留”的，因为子代DNA双螺旋由一条亲代链与一条新合成的链组成。DNA的复制在每轮DNA复制过程中，DNA分子的每条链均被用作合成其互补中心法则DNA是遗传信息的一级载体，能够被转录成RNA，并进行蛋白质的合成，这就是遗传信息流。

DNARNA蛋白质中心法则DNA是遗传信息的一级载体，能够被转录成RNA，并进瞧这一家子！瞧这一家子！ProkaryoticcellEukaryoticcellProkaryoticcellEukaryoticcel基因工程导论课件两种动物性别决定基因的部分比较人与鲸的外形十分不同，但他们仍然由大体上相同的蛋白质组成。尽管人与鲸的分化时间已经很长，但他们许多基因的核苷酸序列还非常相似。图中展示了人与鲸中编码雄性决定蛋白基因的一部分序列，阴影部分是两者完全相同的部分。两种动物性别决定基因的部分比较各种生物共享相同的分子机制图中显示婴儿及小鼠的前额部都有相似的白班，因为他们各自的kit基因都有缺陷。色素细胞的发育和存活都需要这个基因。各种生物共享相同的分子机制基因工程研究发展史准备阶段：1944年，Avery等通过细菌转化研究，证明DNA是基因载体。1953年，Watson和Crick建立DNA分子的双螺旋模型。1958—1971，确立中心法则，破译64种密码子。1960—1970，发现限制性内切酶和DNA连接酶。1972年，首次构建重组DNA分子。基因工程研究发展史准备阶段：基因工程问世1973年，Cohen等首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌的转化；同时，他们将非洲爪蟾含核糖体基因的DNA片段与质粒pSC101重组，转化大肠杆菌，转录出相应的mRNA。基因工程问世1973年，Cohen等首次完成了重组质粒DNA基因工程迅速发展阶段（1）1980—1990年代，基因工程基础研究趋于成熟，发展了一系列新的基因操作技术，构建了多种载体，获得了大量转基因菌株。（2）1980年培育第一个转基因动物——超级鼠。（3）1983年培育出第一例转基因植物——转基因烟草。（4）大量的基因工程药物研究成功。基因工程迅速发展阶段（1）1980—1990年代，基因工程基基因工程的基本程序分—载体和目的基因的分离切—限制性内切酶接—载体与目的基因连接成重组体转—基因序列转入细胞筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定基因工程的基本程序分—载体和目的基因的分离分—载体和目的基因的分离

目的基因的来源和分离基因文库cDNA文库人工化学合成聚合酶链(PCR)反应分—载体和目的基因的分离

目的基因的来源和分离基因工程导论课件切—限制性内切酶的应用切—限制性内切酶的应用限制性内切酶

（restrictionendonuclease）

该酶有三类，即限制性内切酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ。实际工作应用的为限制性内切酶Ⅱ，它能识别和切割双链DNA的特异顺序，产生特异的DNA片段。Ⅱ型具有严格的识别、切割顺序。它以核酸内切方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′端为OH。识别顺序一般为4-6个碱基对。限制性内切酶

（restrictionendonuclea不同限制性核酸内切酶

切割的三种情况产生3′突出粘性末端（cohesiveend):以EcoRI为例：

5′---GAATTC---3′5′---GP

OHAATTC---3′3′---CATAAAG---5′EcoRI3′---CTTAAOHPG---5′产生5′突出粘性末端:以PstI为例：

5′---CTGCAG---3′5′---CTGCApOHG---3′3′---GACCTC---5′PstI3′---GOHpACGTC---5′产生平末端（bluntend):以NruI为例：

5′---TCGCGA---3′5′---TCGpOHCGA---3′3′---AGCGCT---5′NruI3′---AGCOHpGCT---5′不同限制性核酸内切酶

切割的三种情况产生3′突出粘性末端（c接—载体与目的基因

连接成重组体

粘性末端连接平端连接接—载体与目的基因

连接成重组体粘性末DNA连接酶

T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶：MW=68kD，催化两个独立DNA片段5′磷酸基与3′羟基之间形成磷酸二酯键DNA连接酶T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接基因工程导论课件转—基因序列转入细胞

转化感染转染转—基因序列转入细胞转化基因工程导论课件筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定

按重组载体的标志进行筛选核酸杂交法核苷酸序列测定PCR免疫学方法DNA限制性内切酶图谱分析筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定按重组载体的标志进基因克隆的载体

载体（vector）是携带靶DNA片断进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。载体的本质是DNA，具备以下特征：自主复制；有筛选标记；适当大小的分子量适当的限制性内切酶酶切位点；在细胞中拷贝数高。

质粒载体（plasmid）载体噬菌体载体（bacteriophage）基因克隆的载体载体（vector）是携带靶DNA片断进质粒载体

质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA。质粒DNA在细菌中的复制有两种类型，即严紧型和松驰型，后者为高拷贝质粒，常用于基因克隆实验。常用的质粒载体有pBR322，pUC18和pUC19。质粒载体质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA。质粒DN基因工程导论课件基因工程导论课件噬菌体载体-噬菌体载体：gt10、gt11、EMBL4、粘粒载体M-13噬菌体载体T4噬菌体载体噬菌体载体-噬菌体载体：gt10、gt11、EMBL噬菌体载体

插入载体(Subsitutionvector):

gt10和gt11，只有单一的EcoRⅠ酶切位点，只容许几个kB的外源DNA插入。此类载体主要同于cDNA文库的构建。

替代载体（replacevector)：EMBL4，含有EcoRⅠ(E)、SalⅠ(S)和BamHⅠ(B)三个限制性内切酶位点。酶切后可用外源性DNA取代。指入片段长度为9-22kb。主要用于构建基因组文库。噬菌体载体插入载体(Subsitutionvect基因工程导论课件基因工程导论课件基因工程导论课件M13噬菌体载体

M13噬菌体含约64kb的单链闭环DNA分子。在菌细胞内形成过度阶段的双链环状复制型DNA（RF）。双链外源DNA可插入到M13噬菌体，双链复制型DNA中并进行高拷贝复制。亦很容易地从感染细胞中纯化得到并重新导入宿主细胞，进入宿主细胞后，这种双链DNA很快又重新进入复制周期，产生子代噬菌体颗粒。子代噬菌体DNA是单链的，只含有外源DNA的一条链。

主要用于DNA测序和制备单链放射性探针M13噬菌体载体M13噬菌体含约64kb的单链闭环DN

利用T4噬菌体头部表面的非必需外壳蛋白，将目的蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面。具有操作方便、容量大、拷贝数高，表达产物保持相对独立的空间构象和生物学活性、易于分离、免疫原性强等优点。T4噬菌体表面蛋白展示系统利用T4噬菌体头部表面的非必需外壳蛋白，将目的T4噬菌体表面蛋白展示系统

质粒表达系统：表达质粒大肠杆菌噬菌体展示系统：缺失突变型T4-Z1整合质粒大肠杆菌T4噬菌体表面蛋白展示系统质粒表达系统：表达质粒T4噬菌体表面蛋白展示系统SOCgp23SOC-VP2SOCgp23surfacelatticeabcT4噬菌体表面蛋白展示系统SOCgp23SOC-VP2SOC基因工程研究内容基础研究应用研究基因工程研究内容基础研究基础研究（1）基因工程克隆载体研究（2）基因工程受体系统研究（3）目的基因研究（4）基因工程工具酶研究（5）基因工程新技术研究基础研究（1）基因工程克隆载体研究应用研究（1）新药开发（2）转基因植物（3）转基因动物（4）其他方面——酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业、环境保护等应用研究（1）新药开发新药开发1、抗生素：6000多种抗生素，其中约100种被广泛使用，每年市场销售额约100亿美元。利用重组DNA技术，提高抗生素产量和生产效率。2、激素：生长激素、生长激素释放抑制激素、胰岛素、心钠素等。3、其他药物：干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子等。新药开发1、抗生素：6000多种抗生素，其中约100种被广泛用基因工程方法生产的部分人类蛋白质药物（1）蛋白质名称用途a1抗胰蛋白酶治疗肺气肿促肾上腺皮质激素治疗风湿B细胞生长因子治疗免疫系统功能失调降钙素治疗软骨病集落刺激因子治疗血液病、肿瘤辅助治疗绒毛膜促性腺激素治疗不排卵症内啡肽和脑啡肽镇痛剂上皮生长因子促进伤口愈合红细胞生成素治疗贫血用基因工程方法生产的部分人类蛋白质药物（1）蛋白质名称用基因工程方法生产的部分人类蛋白质药物（2）蛋白质名称用途凝血因子VIII治疗血友病凝血因子IX治疗血友病生长激素促进生长生长激素释放因子促进生长胰岛素治疗糖尿病干扰素抗病毒、抗肿瘤白细胞介素治疗癌症淋巴细胞毒素抗肿瘤巨嗜细胞激活因子抗肿瘤用基因工程方法生产的部分人类蛋白质药物（2）蛋白质名称用基因工程方法生产的部分人类蛋白质药物（3）蛋白质名称用途神经生长因子促进神经系统损伤的修复血小板衍生因子治疗动脉粥样硬化松弛素助产剂血清白蛋白血浆补充物生长调节素生长调节素组织型纤溶酶原激活剂溶栓剂肿瘤坏死因子抗肿瘤尿抑胃素抗溃疡药物尿激酶溶栓剂用基因工程方法生产的部分人类蛋白质药物（3）蛋白质名称我国已批准上市的基因工程药物名称适应症重组人干扰素a1b(外用)病毒性角膜炎重组人干扰素a1b乙肝、丙肝等重组人干扰素a2a尖锐湿疣、疱疹、乙肝、丙肝等重组人干扰素a2b乙肝、丙肝重组人干扰素-r类风湿、癌症辅助治疗重组人白细胞介素-2癌症辅助治疗重组人粒细胞集落刺激因子化疗生白细胞重组人红细胞生成素再生障碍性贫血碱性成纤维细胞生成因子创伤、烧伤我国已批准上市的基因工程药物名称基因工程与疫苗甲型、乙型病毒性肝炎疫苗肠道传染病疫苗（霍乱、痢疾等）寄生虫疫苗（血吸虫、疟疾等）流行性出血热疫苗、EB病毒疫苗等爱滋病毒疫苗避妊疫苗：精子避妊疫苗、激素类避妊疫苗基因工程与疫苗甲型、乙型病毒性肝炎疫苗转基因的定义转基因动物Transgenicanimal

–在受精卵时进行基因转移，使最后获得含有外源基因的动物，获得新基因的特性杂合动物Chimericanimal

–采用胚胎干进行基因转移，使动物的某些细胞获得外源基因，这些细胞局限于某些组织中，而其它组织细胞中则并无外源基因，因此呈杂合状态基因敲除Knockoutmutation

–采用同源重组的方法使某个基因发生缺失或灭活，从而失去功能，通常当对受精卵进行基因敲除则产生的动物便因某种基因缺失，而对其生长、发育及其它代谢过程产生影响转基因的定义转基因动物Transgenicanimal–转基因的物种模型Arabadopsis(plant)C.elegans(worm)FruitfliesXenopus(frog)ZebrafishMiceRatsPigsSheepGoatsCows转基因的物种模型Arabadopsis(plant)Rat被转移基因的类型小分子重组DNA(SmallrecombinantDNAmolecules)–采用基因或其cDNAs构建适当的表达载体，以基因转移技术导入宿主细胞中以获得外源基因的表达报告基因(Reporterconstructs)——目标基因的启动子与某些较易检测的基因相连构建成表达盒子，采用检测报告基因的表达来分析目标基因的启动子的强弱及其调控，这些报告基因有GFP,lacZ,luciferase）大分子天然DNA(LargenativeDNAmolecules)酵母人工染色体(yeastartificialchromosomes,YACs)

细菌人工染色体(bacterialartificialchromosomes,BACs)被转移基因的类型小分子重组DNA(Smallrecombi青蛙是最早进行转基因试验的动物之一当时并非采用分离DNA的技术，而是采用核转移技术，即现在采用的动物克隆技术当时建立了核的显微注射技术青蛙是最早进行转基因试验的动物之一转基因小鼠转基因小鼠是最早问世的转基因动物。1982年将生长激素基因转入小鼠获得成功，转基因小鼠的体重是正常个体的二倍，被称为“超级鼠”。转基因小鼠证明了生物技术可以改变动物的天然属性，显示了转基因动物的广阔应用前景。转基因小鼠转基因小鼠是最早问世的转基因动物。1982年将生长转基因小鼠的产生转基因小鼠的产生ExampleoftransgenicmouseExampleoftransgenicmouse基因靶向技术:基因敲除小鼠或突变小鼠基因靶向技术:基因敲除小鼠或突变小鼠Generationofmutant(chimeric)mousestrainelectroporatetargetingvectormicroinjectionintoblackembryoX+/+EScellshomologousrecombination+/-EScellsscreenchimeraprogeny+/++/++/-Generationofmutant(chimeric基因敲除小鼠对于发现有价值基因十分有益，尤其是某些自然状态下不存在的突变株特别提示研究发现，基因敲除小鼠通常并不受基因缺失的影响，许多基因表现为非依赖性，即非必需基因大多数基因表现为多能性，具有多种生物学功能，它们在不同的组织中，以不同的方式进行表达，尤其在发育的不同的阶段的表达对于其生物学功能，从更全面的层次进行理解基因敲除小鼠对于发现有价值基因十分有益，尤其是某些自然状态下应用转基因技术的研究解救突变体以转基因鼠作为生物反应器合成人单克隆抗体合成其它有价值蛋白结构与功能关系研究人类疾病的小鼠模型分析疾病的细胞与分子机制指导治疗药物的筛选指导基因治疗应用转基因技术的研究解救突变体按受累的器官和组织系统列表的鼠疾病模型中枢神经系统疾病–11视觉与听觉障碍疾病–7骨、皮肤和结缔组织相关疾病–16神经和神经肌肉障碍性疾病–22肿瘤–11免疫学和血液系统疾病–17激素和代谢障碍性疾病–24多因性人类疾病–6按受累的器官和组织系统列表的鼠疾病模型中枢神经系统疾病–遗传性疾病的小鼠模型举例镰刀状细胞贫血(Sicklecelldisease)–采用基因敲除和转基因建立小鼠的镰刀状细胞贫血，特性地将内源性球蛋白基因缺失，造成小鼠的镰刀状细胞贫血肺中囊性纤维化(Cysticfibrosis)–主要采用基因敲除模型，也有少数采用转基因多囊肾疾病治疗(Polycystickidneydisease)–y主要采用基因敲除技术嗜眠症(Narcolepsy)–基因敲除模型及思考遗传性疾病的小鼠模型举例镰刀状细胞贫血(Sicklecel转基因鱼1984年，朱作言等首次采用人生长激素基因(hGH)构建了转基因金鱼。目前已有鲫鱼、鲤鱼、泥鳅、鳟鱼、大马哈鱼、鲶鱼、罗非鱼、鲂鱼等被用于转基因研究。已有多种哺乳动物和鸟类的基因被成功地整合到鱼类基因组中。转基因鱼1984年，朱作言等首次采用人生长激素基因(hGH)转基因鱼转基因鱼的主要目的是：（1）提高鱼类生长速度和抗逆性。生长激素基因(哺乳动物、鸟类、鱼类)；抗冻蛋白基因（拟鲽）（2）作为发育生物学研究的模型。转基因鱼转基因鱼的主要目的是：转基因鸡家禽受精卵从输卵管排出需要20多个小时，产出时的卵已有6000多个细胞。蛋产出前的操作：受精后第一次卵裂前取出单细胞卵，在体外进行转基因操作，然后用代用蛋壳作为培养器皿在体外培养至孵化。英国Perryetal采用显微注射法获得了转基因鸡。精子载体法是很有前途的转基因家禽方法。转基因鸡家禽受精卵从输卵管排出需要20多个小时，产出时的卵已转基因鸡蛋产出后的操作：胚胎干细胞(ES)法和原生殖细胞(primordialgermcell,PGC)法。转基因家禽主要以抗病性和改良生产性状为目标。（抗流感病毒基因Mx1、生长激素基因）用鸡蛋生产外源蛋白。转基因鸡蛋产出后的操作：胚胎干细胞(ES)法和原生殖细胞(p转基因家畜哺乳动物体外受精饿胚胎移植技术为转基因家畜的成功提供了有效的技术手段。提高抗病性和改善生产性能。因为家畜与人的生物学相似性，在器官移植、药物生产和特殊疾病模型等方面显示出特殊的价值。转基因家畜哺乳动物体外受精饿胚胎移植技术为转基因家畜的成功提In1997,researchersatScotland'sRoslinInstitutesparkedinternationaldebatewhentheyannouncedthecloningofasheepnamedDolly.Theeventbroughthumankindtoanothercrossroadsofscientific