生物饵料培养课件第二章 微藻

生物饵料培养课件第二章微藻第二章单细胞藻类的培养！什么是单细胞藻类？其特点？！！人类培养单细胞藻类的历史？！！！开展单细胞藻类培养的优势和劣势？！！！！单细胞藻类的应用现状？1、单细胞藻类的概念与特点单细胞藻类，unicellularalgae,也叫微藻microalgae，通常指单个细胞或数个细胞组成的微小藻类按生长环境分类按生活方式分类按营养方式分类微藻气生微藻水生微藻陆生微藻海水微藻淡水微藻微藻浮游微藻底栖微藻微藻光自养微藻异养微藻兼性营养微藻2、人类培养单细胞藻类的历史19世纪末，开始培养栅藻和小球藻，用于植物生理学研究20世纪初，开始培养单细胞硅藻用于水产无脊椎动物的饵料二次大战后，因缺粮，小球藻开始作为粮食和饲料的替代品进行培养研究20世纪七八十年代，大量单细胞藻类作为水产动物饵料而进行培养，并取得了较大的突破我国的单细胞藻类的培养历史最早报道在1924年（朱树屏）1957年后，开始单细胞藻类的分离、筛选和培养研究1966年后，单细胞藻类正式作为水产动物的饵料在马氏珠母贝的人工育苗中应用，开始了单胞藻的实际生产和应用时期目前，我国已培养并有应用的单胞藻有30多种3、开展微藻培养的优势及劣势优势A整个生物体都可被利用，没有废弃物B营养丰富，富含蛋白，维生素和高不饱和脂肪酸C相比农作物，单位时间单位面积的产量高D生长周期短，繁殖快，适宜条件下指数增长E可利用海水培养，是开发海洋的有效途径F可进行自动化生产Speciesprotein(g/m2/year)fatenergycarbohydrateChlorella23001113259001315Rice/wheat431119285Soybean582319186劣势最大的问题，藻细胞的采收，耗能其次是培养条件相对高4、单细胞藻类的应用情况A作为食品及食品的添加剂B饵料或饲料添加剂C提取活性物质D水处理E生物学研究F水产养殖上生态防病G生产新能源BiofuelThecentralroleofmicro-algaeinmariculture第一节、常用单细胞藻类的培养生态及应用

第二节、单细胞藻类的培养方式及培养设施

第三节、单细胞藻类的繁殖特性及影响藻类繁殖的因子

第四节、单细胞藻类的培养方法

第五节、单细胞藻类生产中的敌害防治

第六节、单细胞藻种的分离和保存第七节、单细胞藻类培养的新进展与展望第一节、常用单细胞藻类的培养生态及应用绿藻门：小球藻、扁藻、微绿球藻硅藻门：三角褐指藻、小新月菱形藻、牟氏角毛藻、中肋骨条藻、舟形藻金藻门：等鞭金藻3011、湛江等鞭金藻、巴夫藻蓝藻门：螺旋藻1、小球藻Chlorellaspp.分类地位：绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，卵孢藻科，小球藻属形态：球形或广椭圆形，有杯状或边缘生板状色素体，3~5um繁殖方式：无性繁殖以似亲孢子的方式进行适宜培养条件温度10~35℃盐度：可驯化最适光强10000lx最适pH6~8应用：培养动物性生物饵料水色及水质的调控2、微绿球藻（眼点拟微球藻）

Nannochloropsisoculata分类地位：绿藻门，绿藻纲，四胞藻目，胶球藻科形态：球形，2~4um，色素体一个，淡绿色，淀粉核1~3个，细胞壁极薄繁殖方式：二分裂繁殖适宜培养条件温度25~30℃盐度：4~36最适光强10000lx最适pH7.5~8.5应用：贝类育苗，河蟹幼体及动物性生物饵料，水色及水质的调控3、亚心形四爿藻

Tetraselmissubcordiformis分类地位：绿藻门，绿藻纲，团藻目，衣藻科，扁藻属（四爿藻属）形态：扁平的广卵形，前端中央有凹陷，鞭毛四条，有一大型杯状绿色的色素体，11~14um×7~9um×3.5~5um繁殖方式：细胞纵分裂，可形成休眠孢子适宜培养条件温度20~28℃盐度：30~40光强5000~10000lx最适pH7.5~8.5应用：贝类育苗，轮虫培养4、三角褐指藻

Phaeodactylumtricornutum分类地位：硅藻门，羽纹纲，褐指藻目，褐指藻科，褐指藻属形态：卵形（8×3um）、梭形（20um）或三出放射形（10~18um），随环境条件而变繁殖方式：平行分裂，藻体不会缩小适宜培养条件温度10~15℃盐度：25~32光强3000~5000lx最适pH7.5~8.5应用：甲壳类、贝类及棘皮动物的幼体饵料5、小新月菱形藻

Nitzschiaclosterium

分类地位：硅藻门，羽纹纲，双菱形目，菱形藻科，菱形藻属形态：直或月牙形的纺锤形，12~23um×2~3um繁殖方式：纵分裂适宜培养条件温度15~20℃盐度：25~32光强3000~8000lx最适pH7.5~8.5应用：甲壳类、贝类及棘皮动物的幼体饵料6、牟氏角毛藻

Chaetocerosmuelleri

分类地位：硅藻门，中心纲，盒形藻目，角毛藻科，角毛藻属形态：单细胞或2~3细胞组成的群体，壳面椭圆或圆形，壳环面长方形，四角长有细而长的角毛，两端角毛以细胞体为中心而略呈S形，细胞体环面大小3.45~4.6um×4.6~9.2um繁殖方式：二分裂繁殖，可形成休眠孢子或增大孢子适宜培养条件最适温度30℃盐度：10~15光强10000~15000lx最适pH8.0~8.9应用：斑节对虾、泥蚶育苗7、中肋骨条藻

Skeletonemacostatum

分类地位：硅藻门，中心纲，圆筛藻目，骨条藻科，骨条藻属形态：细胞体为透镜或圆柱性，直径6~7um，周缘有细长的刺，与其他细胞的刺连接成长链繁殖方式：一般为二分裂繁殖适宜培养条件温度20~30℃盐度15~30光强5000lx最适pH7.5~8.5应用：斑节对虾、河蟹育苗8、等鞭金藻3011

Isochrysisgalbana

分类地位：金藻门，普林藻纲，等鞭藻目，等鞭藻科，等鞭藻属形态：无细胞壁，形态多变，大多数呈椭圆形，前端有两等长的鞭毛，鞭毛基部有液泡，细胞中央有眼点，活动细胞4.4~7.1um×2.7~4.4um×2.4~3um繁殖方式：通常二分裂繁殖，也可形成内生孢子适宜培养条件最适温度20~30℃盐度10~30光强7000~9000lx最适pH7.5~8.5应用：贝类及棘皮动物的育苗9、湛江等鞭金藻

Isochrysiszhanjiangensis

分类地位：金藻门，普林藻纲，等鞭藻目，等鞭藻科，等鞭藻属形态：卵形或球性，前端有两等长的鞭毛，6~7um×5~6um繁殖方式：二分裂适宜培养条件最适温度25~32℃盐度22.7~35.8光强5000~11000lx最适pH7.5~8.5应用：贝类及棘皮动物的育苗10、绿色巴夫藻

Pavlovaviridis

分类地位：金藻门，普林藻纲，巴夫藻目，巴夫藻科，巴夫藻属形态：无细胞壁，圆形或椭圆形，有两不等的鞭毛，无眼点，有微弱趋光性，大小6×4.8×4um繁殖方式：二分裂培养生态：广盐广温种最适盐度10~4最适温度15~30℃最适光强4000~10000lx应用：甲壳类和贝类的育苗

11、钝顶螺旋藻

Spirulinaplatensis

分类地位：蓝藻门，蓝藻纲，藻殖段目，颤藻科，螺旋藻属形态：藻体螺旋状，蓝绿色，无色素体和细胞核，顶端细胞钝圆，长400~600um，宽4~5um繁殖方式：二分裂或形成藻殖段适宜培养条件最适温度30~37℃盐度可驯化光强30000~35000lx最适pH8.6~9.5应用：观赏鱼配合饵料、贝类和甲壳类育苗生物饵料培养

——单细胞藻类的培养2上海海洋大学水产与生命学院黄旭雄第二节、单细胞藻类的培养方式及培养设施培养方式培养设施按培养规模分一、培养方式按培养纯度分按培养密闭程度分按采收方式分纯培养：即无菌培养。要求最为严格，生产性培养中很难做到单种培养：指可有细菌存在但只有一种藻类的培养。一般室内水泥池培养多为单种培养混合培养:也称多种培养,是指一培养体系中存在两种或两种以上的微藻细胞同时生长室外土池施肥培养单细胞藻类是一典型的混合培养

开放式培养：指藻液直接与外界空气相通的一种培养方式，生产性培养的主要方式，培养设备简单，但易受敌害生物的污染封闭式培养：指单胞藻在一相对封闭的体系中培养，主要用于藻种保藏，有时也用于生产性培养中藻种级培养，培养体系一般在100升以下

封闭式培养开放式培养一次性培养（批次培养）指一次接种培养后一次性全部采收

单胞藻培养最常用的方式半连续培养是指在一次接种后，藻液培养到一定密度时部分采收，同时添加等量的新培养液的生产方式连续培养是指在接种后，根据培养液中藻密度或营养盐的消耗量，连续采收藻细胞和添加营养盐

连续培养多用于封闭式自动化培养，设备成本高，藻细胞生长快，产量高藻种培养（一级培养）指以保存藻种为目的藻类培养，多采用封闭式不充气培养方式培养中继培养（二级培养）指为生产性培养提供大量藻种为目的藻类培养，可采用封闭式或开放式培养方式生产性培养（三级培养）是以大量生产藻细胞为目的培养，多采用开放式（封闭式）充气培养一级培养（藻种培养）二级培养（中继培养）三级培养（生产性培养）二、单细胞藻类的培养设施

1、藻种室：藻种分离、培养、保存及检查的场所一般面积不超过10平方米保温性能良好，防污染能力强易清洁消毒，内墙面及台面铺设白色瓷砖应配有恒温光照培养箱、显微镜、酒精灯、接种针、人工光源、操作平台等设备，以及三角烧瓶等玻璃器皿和各种营养盐及试剂2、清洗消毒室：

进行培养器皿和工具清洗及消毒的场所面积一般在10~15平方米应配备有清洗水池、消毒池等设施和烘箱、高压蒸汽灭菌锅、炉灶等设备3、培养室：

进行藻类的中继培养和生产性培养的场所装配有培养容器、培养架和培养池等设施设计上要求采光好，屋顶一般用透光的玻璃钢波纹板覆盖，最好东西走向配备有人工光源，最好可调温

4、培养容器：

有各种规格的三角烧瓶、广口玻璃缸、细口玻璃瓶、透明塑料袋等。主要用于小型培养和中继培养5、培养池：

用于生产性培养用，一般池深80厘米，面积在2~10平方米。池内壁贴白色瓷砖6、水处理系统：

单细胞藻类培养比苗种培养对用水的要求更严格在单胞藻培养用水处理系统中通常需配备过滤装置和消毒装置最常用的过滤装置为沙滤池7、充气系统

在生产性培养中，为了促进藻类生长，常需往培养池中充气，可利用育苗池的充气系统但为了预防敌害生物通过空气污染藻液，空气在注入藻液之前最好经过空气过滤器或洗气装置小型单胞藻充气培养中的洗气装置1、进气管；2、硫酸铜溶液；3、气泡石；4、出气管；5、蒸馏水单细胞藻类培养车间平面图1、水靴消毒池；2、消毒室；3、工具清洗消毒池；4、培养用水消毒池；5、保种室；6、保种区；7、藻种扩大培养区；8、操作区；9、二级培养池；10、三级培养池；11、培养室生物饵料培养

——单细胞藻类的培养3上海海洋大学水产与生命学院黄旭雄第三节、单细胞藻类的繁殖特性及影响藻类繁殖的因子一次性培养中单细胞藻类生长繁殖特性单细胞藻类生长繁殖特性在培养生产中的应用影响单细胞藻类生长的环境因子

一次性培养中单细胞藻类生长繁殖特性可分成五个时期，依次为1、延缓期2、指数生长期3、相对生长下降期4、静止期5、死亡期

1、延缓期生长特点：接种后的短时间内藻类繁殖缓慢，细胞数无明显改变产生的原因：藻种质量问题藻种数量问题新旧培养液成分的差异2、指数生长期

生长特点：藻细胞数量随时间呈几何级数递增相对生长常数K表示生长繁殖效率

K=(lnN—lnN0)/T影响生长繁殖效率的因素：藻的品种培养条件3、相对生长下降期

生长特点：藻细胞繁殖趋缓，细胞数增加速度减慢产生的原因：随着培养时间的延长，培养液中产生了藻类生长限制因子

营养盐耗净二氧化碳供应不足培养液酸碱度改变藻类细胞浓度过密，光照不足藻类代谢废物的自体抑制

4、静止期

在相对生长下降期内，由于限制因子的作用不断增加，藻类生长逐渐下降，最终生长停止，进入静止期在静止期，新生的藻细胞数和死亡的藻细胞数趋于平衡，藻液中藻细胞数保持相对恒定

5、死亡期

在死亡期内，藻细胞大量老化死亡，细胞数量迅速减少不同藻类及培养条件下，死亡期出现的时间有很大的差异单细胞藻类生长繁殖特性在培养生产中的应用

如何缩短或消除延缓期的出现？

如何增加指数生长期的生长效率？如何延长指数生长期，推迟相对生长下降期出现？

如何缩短或消除延缓期的出现？1、缩短延缓期在藻类培养上的重要性接种后延缓期越短，接种培养成功的可能性越大2、缩短或消除藻类接种后出现延缓期的措施1）

选择处于新陈代谢快，生长旺盛（处于指数生长期）的藻细胞作藻种2）

接种时保证藻种的浓度达到一定的数量，选择偏高浓度接种3）选择合适的培养液（包括配方组成及营养盐浓度），减少新旧培养液之间的营养盐差异如何增加指数生长期的生长效率？选择生长性能优良的品系提供其生长所需的各种最佳环境因子和营养水平如何延长指数生长期，推迟相对生长下降期出现？1、适时添加营养盐2、人工充二氧化碳（含1%~5%二氧化碳的混合空气）3、定期检测并调整培养液的pH4、增强光照强度5、改变培养方式影响单细胞藻类生长的环境因子

光照（光源，光质，光强，光周期）温度盐度pH营养素常量元素（碳、氢、氧、氮、硫、磷、钾、钙、镁、铁等）微量元素（硼、锰、锌、铜、钼、钠、硅、钴、矾、锶等）辅助生长因子（主要指一些维生素，VB12、VB1、生物素等）植物生长调节剂（植物生长激素等）

生物因子生物饵料培养

——单细胞藻类的培养4上海海洋大学水产与生命学院黄旭雄Productionschemeforbatchcultureofalgae第四节、单细胞藻类的培养方法

单细胞藻类的培养过程可分为五个步骤容器和工具的消毒培养液的配制接种培养管理采收一、容器和工具的消毒目的：消灭藻类的捕食者和竞争者方法：加热消毒：高温高压灭菌直接灼烧法煮沸法烘箱干燥法化学药品消毒：

70%酒精法高锰酸钾法漂白粉法稀盐酸法二、培养液的配制培养用水的消毒配方的选择营养盐用量的计算营养盐的添加培养用水的消毒一级培养用水砂滤——烧开（或高压灭菌）——冷却二级培养用水砂滤（或脱脂棉过滤）——烧开——冷却三级培养用水砂滤（或脱脂棉过滤或暗沉淀）——20~100PPm漂白粉12h——2/3量的硫代硫酸钠中和——2h以上用上清液配方的选择与营养盐用量的计算根据培养藻类对各种营养盐的需求选择适宜配方配方中常量元素可直接直接称取或先配成母液后移取，微量元素通常先配成浓缩1000倍的母液后移取F/2配方NaNO3------------------------74.8mgNaH2PO4-----------------------4.4mgNa2SiO3·9H2O----------8.4-16.7mgF/2微量元素溶液---------------1ml

F/2维生素溶液-----------------1ml海水--------------------------1000mlF/2微量元素溶液ZnSO4·4H2O--------------------23mg

MnCl2·4H2O-----------------17.8mgCuSO4·5H2O-------------------10mg

FeC6H5O7·5H2O----------------3.9gNa2MoO4·2H2O---------------7.3mg

CoCl2·6H2O--------------------12mgNa2EDTA-----------------------4.35gH2O---------------------------1000mlF/2维生素溶液维生素B12-----------------0.5mg维生素H------------------0.5mg维生素B1----------------100mg

H2O---------------------1000ml营养盐的添加逐一加入营养盐，并在下一种营养盐加入之前进行充分搅拌。营养盐加入的顺序：先氮，后磷，再铁……，直至所有营养盐都按需加入到消毒水中

三、接种成功接种的关键是把握好藻种的质量、藻种的数量和接种的时间质量要求无敌害生物污染、生活力强、生长旺盛，上浮明显（运动藻），藻液的外观颜色正常，无大量沉淀和明显附壁现象藻种的数量要求：保证高比例接种

藻种细胞浓度达到或接近藻液的采收浓度藻种级培养时的藻种量与培养液量之比为1：2~1：3中继培养和生产性培养的接种比例一般不小于1：10~1：20接种时间要求：一般应选择在晴天上午8时~10时接种，这样能够把上浮的、运动能力强的、生命力旺盛的藻细胞选作藻种，以缩短接种后的延缓期四、单细胞藻的培养管理

分为两大部分：日常管理和敌害生物的防治日常管理工作包括1、藻细胞生长环境因子的监测和调控2、藻液生长情况检查藻液生长情况检查宏观上，可检查藻液的颜色、藻细胞的运动或悬浮的情况、有无藻细胞沉淀或附壁，有无菌膜或敌害的产生等微观上，可在显微镜下检查藻细胞的形态有无异常，有无敌害生物的出现，藻细胞数量增加情况等五、单细胞藻类的采收

采收时机：藻类进入相对生长下降期单细胞藻类的定量方法：细胞计数（血球计数板）法光密度（分光光度计）法重量法浓缩细胞体积法

单胞藻的采收方法使用连续式离心分离机过滤收集沉淀收集直接投喂生物饵料培养

——单细胞藻类的培养5上海海洋大学水产与生命学院黄旭雄第五节单细胞藻类生产中的敌害防治

单胞藻培养过程中敌害生物的危害方式掠食如：轮虫游捕虫急游虫变形虫聚缩虫钟虫累枝虫喇叭虫尖鼻虫等分泌有害物质对单胞藻起抑制和毒害作用如：多甲藻游捕虫急游虫变形虫聚缩虫钟虫喇叭虫累枝虫多甲藻单胞藻培养过程中敌害生物的污染途径

1、培养用水2、空气3、容器和工具4、肥料或营养盐5、某些昆虫6、不严格的操作单胞藻培养过程中敌害生物的防治

对待敌害生物的污染和危害应实行的措施以防为主，防治结合有效预防措施1、严禁非工作人员进入培养室。工作人员必须穿水靴，进培养室水靴要消毒2、加强操作人员的防污染意识，严禁用手直接接触藻液3、培养池及培养用水需经足量消毒后方可使用4、水泵等工具必须每天消毒，消毒后的水泵及工具在使用前严禁放在未经消毒的地方5、不同藻、不同池的用具在未经消毒前严禁混用，以免交叉污染。6、在水温较高时适当提高消毒用药浓度并把好接种关7、调节环境条件，满足藻类适宜生长的要求8、做好藻种的分离、提纯和复壮9、发生严重敌害生物污染的藻液，要先用100毫克/升有效氯杀灭后再放掉清除、抑制或杀灭藻液中的敌害生物的方法

过滤法清除大型敌害生物

使用200目筛网过滤去除卤虫，枝角类等使用药物抑制或杀灭敌害生物加入0.03%医用氨水杀灭尖鼻虫改变环境条件杀灭敌害生物提高盐度消灭盐藻中的敌害生物游仆虫生物饵料培养

——单细胞藻类的培养6上海海洋大学水产与生命学院黄旭雄第六节单细胞藻种的分离和保存

一、藻种的分离包括采样、预培养和分离三步骤采样：从相应的水体和土壤中采集目标藻种预培养：目的：使目标藻种成为优势种，方便分离关键措施：合适的培养液，合适的培养条件，合适的培养时间分离的方法通常采用下列方法：1、微吸管分离法2、微水滴分离法3、平板分离法4、梯度离心法5、趋光法二、藻种的保藏

保藏方法：液体培养基保藏固体培养基保藏固液双相培养基保藏超低温保存常规保