心肌电生理学绪论课件

第一章绪论电生理学研究简史及启示第二章心肌电生理学研究方法第三章离子通道第四章离子电流第五章心肌细胞的电活动第六章心肌兴奋性及其周期性变化第七章心肌的传导性第八章心肌的自律性第九章离子对心肌电生理特性的影响第十章离子通道病第十一章抗心律失常药物作用的离子基础

刘泰摓心肌电生理学第一版北京大学出版社1988刘泰摓心肌电生理学第二版北京大学出版社2000刘泰摓心肌电生理学—离子通道、离子载体和离子流人民卫生出版社2003何瑞荣心血管生理学人民卫生出版社1987徐成斌等心脏电生理学与药理学基础与临床军事医学科学出版社1998徐叔荣等药理实验方法第三版人民卫生出版社2002金荫昌分子药理学天津科技出版社1990陈宜张分子神经生物学人民军医出版社1995刘安西细胞膜离子通道中央民族学院出版社1990韩济生等神经科学纲要北京大学,协和医大联合出版社1993苏静怡等心脏从基础到临床北京大学,协和医大联合出版社2000贾宏均等离子通道与心脑血管疾病人民卫生出版社2001陈军膜片钳实验技术科学出版社2001康光华膜片钳技术极其应用科学出版社2003朱妙章等心血管生理与临床高等教育出版社2004刘振伟实用膜片钳技术军事医学科学出版社2006陈军膜片钳实验技术科学出版社2001

第一章绪论电生理学研究简史及启示

IntroductionBreiflyHistoryofElectrophysiologicalResearch引言

19世纪，恩格斯在总结当时的自然科学成就时就指出：“地球上几乎没有一种变化发生而不同时显示出电的现象”。

生物电现象是指生物机体在进行生理活动时所显示出的电现象。在生理学的发展历史上，生物电现象的研究，是同生物组织的另一重要特性兴奋性的研究相伴随进行的。

诺贝尔奖获得者，被誉为“世界生理学之泰斗”的生理学家I.P.Pavlov说过：“科学是随着研究方法所获得的成就而推向前进的，每当研究方法向前迈进一步，我们就仿佛提高了一步，随之，我们面前就开辟了一个充满新鲜事物的更广泛的远景”。五十多年来，有关神经和骨髓肌等可兴奋细胞电生理学研究进展，极大地推动了对心肌细胞电活动的研究。随着电学知识的积累和电测量仪器的精密化，生物电现象的研究也获得了更有力的理论基础和实验手段。回顾电生理学研究的每一步，正是随着研究方法的不断更新而获得的成绩，学习它的历史将对我们的科学思维方法有所启示。

心肌电生理学的研究很大程度上直接受神经电生理研究的影响、方法一样。

二、神经肌肉电生理学研究简史

对于生物电现象的兴趣可以追溯到两千年前。在古希腊，Aristotle(B.C.384~322)在其著作中就描述过电鹞鱼(Torpedomarmarota)放电产生电击作用的现象。17世纪已知电鹞鱼的电器官是一种特化的肌肉，称为肌电板，每一肌电板可产生0.14伏的电动势，其放电过程受到神经系统的控制。1937年发现电鹞鱼含丰富的Ach。电器官用于产生导航的电信号和击昏被捕食的动物。

1786年意大利Bologna大学解剖学教授LuigiGalvani无意中发现，如果用金属导体连接蛙腿肌肉与神经，则肌肉就会发生颤抖。他把这个现象的发生原因归之于“动物电(animalelectricity)”。他认为神经与肌肉带有相反的电荷，而从属导体的作用仅是把神经与肌肉之间的通路接通而已。他的论文发表于Bologna学院1791年的会议录中。这个著名著作的名称是“Deviribuselectricitatusinmotumusculari”，它引起了当时的一场争论。一般认为电生理学发源于此年代。

Galvani的同时代人物理学家Volta不同意Galvani的见解，他认为Galvani实验中发现的现象，是由于实验中用的金属性质不同所致。他后来因此发明了伏特电池，他用一组铜板和另一组锌板，中间隔以盐水，由于不同金属与电解质相接触，因而产生电动势，即所谓Volaticpile。

电生理学的发展，几乎完全是与电学仪器的发明分不开的。

1825年，Nobili发明了电流计，并用此仪器证实了肌肉电流的存在。

1838年，Matteucci用粗糙的电流计做实验，发现肌肉和神经在其完好部份和损伤部分之间存在差电位差，以损伤处较负，当时称为损伤电流。

1848年，德国科学家DuBoisReymond(1818-1896)用电流计测量神经传导时的电变化，他将电流计的一极与神经表面相接触，而另一极则连于神经的切面。他发现当神经进行传导时，伴有电变化。电表的偏动表明这种电流方向是正常部位向损伤部，他把这种变化称之为“负荷电变化（negativevariation)”。实际上相当于现在的单相动作电位。他在自己研究工作基础上写出了描述生物电活动规律的第一本专著《动物电的研究》。

1850年，Helmoholtz（1821~1894德国）测定了神经传导速度。这是神经生理学发展中的一件大事。在此以前都认为既然电的传导速度待于光速，因而怀疑神经的传导速度也是光速。Helmoholtz以很简单的试验测出，蛙神经的传导速度仅20~30米/秒。后来又使用的弦线电流计和毛细管静电计，Holmgren在1865年记录到网膜电图，Einthoven在1901年记录到心电图；Berger在1920年记录到脑电图，等等。

1879年，Hermann提出了生物电现象的变质学说(Alterationtheory)。他指出，在损伤的神经或肌肉中所出现的负电位差，是发生于损伤一端的，后来又进一步证明了完全死亡的组织上是不产生这种负电位差的。这种正常部位与损伤部位之间的电位差，称为损伤电位(injurypotential)或分界电位(demarcationpotential)。这种电流则相应地称为损伤电流（injurycurrent）或分界电流(demarcationcurrent)。Hermann认为，这种电流是损伤时才产生的。因此当组织损伤时，在生理和化学作用的影响下产生了局部的变质，因此与正常部位之间产生了电位差。

1902年，生理学家Bernstein提出了生物电发生的膜学说。他了解到胞内K+浓度高于胞外，因此，K+必有向外扩散的倾向，它将胞内正电荷移向膜外，在胞内形成了负电位，这个电位继续发展直到它的大小能阻止K+的净外流为止。这一学说认为神经或肌肉的细胞膜只对K+有通透性，而对较大的阳性离子和阴性离子则均无通透性。在这种情况下，由于细胞内外钾离子分布不均匀，故在膜两侧形成一个电位差，此即为静息电位（restingpotential)。Bernstein并设想当神经或肌肉发生兴奋而传导时，细胞膜的选择通透性暂消失，而变为无任何选择性的膜，以此来解释动作电位的产生。按照Bernstein的膜学说看来，动作电位实际上即是静息电位的暂时消失。直到1939年之前，这一学说一直是电生理学的主要理论基础。

由于没有细胞内记录，Bernstein的学说的大部分定量性质都无法得到检验。

1912年，英国剑桥大学教授Adroam确定了动作电位产生的“全或无”性质。

1917年，KeithLucas进一步证论“全或无”定律以及兴奋的定量方面，如发生兴奋需要一个最低的强度增加的坡度等。

英国牛津大学（oxfordUniversity）生理学教授Sherrington研究了不同神经元的相互作用，并引入了一个非常有用的制备，把它用于反射弧的生理学研究。他首先于1897年建议用“突触”(synapse)一词用以描写两个神经元之间的紧密接触点，于1906年发表了在神经生理学上具有划时代意义的著作“神经系统的整合作用”(Theintegrativeactionofthenervoussystem)。在书中，他通过对简单的及复杂的反射的仔细研究，系统地分析了神经系统是如何记进行工作的。他的分析问题的方法及精辟的见解，成为整整半个世纪以来中枢神经系统生理的基本依据，也是神经系统电生理的基本出发点。可以说，Sherrington学派是世界上最大的一个神经生理学派。谢灵顿Sherrington

艾德里安Adrian

Adrian和Sherrington两位神经生理学家对于神经元的机能研究以及信息由一个细胞向另一个细胞传递的机制的研究作出了重大贡献，他们俩一起获得了1932年的诺贝尔医学-生理学奖。

1901年，荷兰生理学家Einthoven发明了弦线电流计，这是一个重大贡献，初步解决了电生理仪器中所要求的速度问题。早期许多工作都是用弦线电流计照相记录的。Einthoven发明的心电图机，开创了从体表记录内脏电流动的先河，1924年获诺贝尔奖。

1922年，美国生理学家Erlanger和其助手Gasser在这生理学中第一次采用阴极射线示波器，研究了枪乌贼单一神经纤维的动作电位。这在电生理学方法技术上是一次巨大的飞跃，应该讲是现在电生理技术的鼻祖。他们合著了“神经活动的电信号”(Elodricalsingnsofnervousactivity)一书，并于1937年发表。现代电生理发展中，基本技能与方法都渊于单纤维、微电极、示波器。正是因为这一伟大功绩，他们二人被授于1944年诺贝尔奖。

微电极技术的应用，是电生理研究史上的又一重要里程碑。

1939年，Cole、Curtis、Hodgkin和Huxley（后两者均为英国剑桥大学教授，应邀到Gasser的实验室工作），首次成功地进行了乌贼(loligoforbies)巨轴突的轴突内记录。他们将园柱形的金属或玻璃微管，沿轴突走行，纵行刺入轴突内，记录了神经纤维的电活动。这是一个划时代的成就。

1940年，21岁的女研究生Graham开始在芝加哥大学Gerard的实验室用微电极作细胞内穿刺，于1941年记录到细胞内“真正电位”。当时记录到静息电位平均为41mV，微电极尖端直径10μm。

1942年，Gerard在美国生理学会报告时，其电极尖端平均直径为5-10μm，静息电位平均为54mV。

1946年，Graham离开后，一位来自中国的研究生Ling在Gerard实验室学习拉制微电极，并于1947年使微电极的尖端直径小到1μm，阻抗高达100MΩ,记录的蛙肌细胞的静息电位达78mV。由于Gerard当时的主要兴趣是研究静息电位，只限于观察K+、Ca2+、pH、药物、牵拉以及代谢产物对静息电位的影响，从而失去了发展动作电位记录技术和理论的时机。

1948年，Adrian的得意门生Hodgkin根据kuffler的建议，到Gerard实验室向Ling学习拉制和充灌微电极的技术。Hodgkin只在那里呆了几天，就领悟到该技术的窍门。回国后，Hodgkin同Nastuk一起，改用了3mol/LKcl（而不是等渗）充灌微电极，借以降低电极电阻和液体接头电位，并在微电极与放大器之间多加了一个阴极跟随器，借以减少栅极电容。同年底，他们即清楚地记录到超射达30-40mV的动作电位，并证明细胞外钠的缺如可降低动作电位幅度。由于Hodgkin学派的巨大成就，以后发展到进一步修正Bernstein膜学说。成为动作电位的钠学说（动作电位的离子学说）。

假说：膜两侧溶液成分不同；膜对离子具有选择性通透性，这两种通透性在动作电位时发生改变。静息时，对K+通透，兴奋对Na+通透超过K+，通透性变化说明了神经的电兴奋。

在Hodgkin和Nastuk的工作未发表前，微电极细胞内记录动作电位的技术已迅速传播：Fatte和Katz应用该技术首先记录到终板电位乃至微终板电位。Sherrington的学生Eccles（澳大利亚生理学家）应用该技术，不到两年内，就从猫脊髓运动神经元记录到漂亮的兴奋性突触后电位（EPSP）和抑制性突触后电（IPSP）。

由于他们应用微电极技术，对于神经系统两大基本理论问题神经冲动的传导及中枢突触的传递的重要贡献。Hodgkin、Huxley、Eccles三人联合获得了1963年的诺贝尔奖。然而，微电极虽然记录到了细胞内的电变化过程，但尚不是以阐明产生这种电变化的原因。从细胞或亚细胞水平阐明生物电的产生机理，搞清楚电变化和细胞其它基本功能之间的联系，始终是电生理研究中的一个重要内容。Bernstein在1902年提出的膜学说，从带电离子在细胞膜两侧的不均匀分布和跨膜移幼来说明细胞电变化的产生，为理解生物电的产生原理开创了正确的途径，但即于当时的技术条件，这个学说长期没有得到实验证明。30~50年代，英国的Hodgkin和Huxley，美国的Curtis和Cole，利用枪乌鲗（Squid）的巨大神经轴突进行了一系列研究，不仅给经典的膜学说给予了实验检验，而且增加了理论内容。

1951年，Hodgkin和Huxley首先应用电压钳制技术（voltageclamptechnique)，对枪乌賊轴突膜的离子通透性变化的电压及时间依从关系做出了明确的动力学描写。通过定量实验研究，建立了Na+、K+离子通道门控机构的模型（H-H模型）提出了膜离子学说，这是近代兴奋学说的基石。

他们应用负反馈技术使膜电位固定于某一选定电位,以研究动作电位产生过程中膜的离子通透性与膜电位之间的依从关系。结果有力地说明：动作电位是由于跨膜离子流运动所产生，而离子的流动又是膜通透性发生了电压和时间依从性改变的结果。

1969年，Katz证实了神经肌肉接头处突触传递中突触前膜对Ach“量子式”释放作用于后膜上受体，诱发终板电位和微终板电位。1970年获诺贝尔奖。

1974年，Keynes等测量了闸门电流（gatingcurrent），确认了钠通道门控过程与通道组分中带电成分运动的依从性。

由Hodgkin等提出的一些有关兴奋膜的电学特性的实验方法、概念、理论和数学-物理模拟，至今仍然是研究和描述各种生物电现象的基础。

走完了上述电生理技术发展的长途，不难看出，每一次技术的进步都带来了一次电生理的发展的前进，乃至飞跃。为生理学和医学积累了大量资料，记录了各种电现象如ECG、EMG、EEG、IPSP、EPSP等，创立了电生理现象及其有关理论，并由此给生理学带来了空前的辉煌。应该说，生理学由器官水平发展到细胞水平，应注意主要归功于电生理技术的进步。

既然细胞电活动的基础是膜离子通道，若能直接研究离子单个通道电活动的规律，无疑将是一大进步。

1976年，德国马普生物物理化学研究所的Neher和Sakmann在电压钳制技术基础上，采用与电压钳制技术相同的原理创建了膜片钳制技术(patchclamptechnique)，利用该技术从肌细胞记录到Ach激活的离子单通道电流。

1980年，Sigworth等在记录电极内施加-5~50cmH2O的负压吸引，得到了10~100GΩ的高阻封接（gigaseal)，实现了单极电极既钳制膜电极又记录单通道电流。

1981年，Hamill和Neher,Sakmann对该技术进行了改进，引入了膜片游离技术，使该技术更进一步完善。

1983年10月，《Single-ChannelRecording》一书的问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。

内尔(Neher)萨克曼(Sakmann)（1944-）（1942-）（德国细胞生理学家）（德国细胞生理学家）

合作发明了膜片钳技术，并应用这一技术首次证实了细胞膜存在离子通道。这一成果对于研究细胞功能的调控至关重要，可揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机理，并提供治疗的新途径。二人共获1991年诺贝尔奖。

由于膜片钳是对单个离子通道在各种电位状态及每种电位状态下对产生电流的离子作出定性、定量的分析，从而成为目前研究通道的直接测定，为研究离子通道结构与功能关系提供了许多关于生物电特性的新资料。为此，Meher和sakmann获得者1991年诺贝尔奖。

Patchclamp是生理学技术近30年的一颗明珠。Patchclamp从1976年到1981年5年期间,从构想到完善；从1981年–1982年一年间，世界上就有25个有名的实验室开始使用这个技术，截至1991年，Patchclamp已在不同动物的肝脏、脾脏、胃肠、心肌、骨骼肌、内分泌等各类40种细胞上应用并取得了研究成果。现在在美国、加拿大和欧洲一些主要国家从事电生理研究的实验室几乎都采用这一技术。在重要的学术会议上，电生理文章几乎都要用这个技术来完成。

膜片钳技术和分子生物学技术被誉为20世纪生命科学技术的两大革命

Patchclamp技术的诞生延长了电生理的科学寿命。Patchclamp技术诞生前，细胞内微电极（包括多管微电极）技术和电压钳制技术已经不能为生理学提供新的，带有质跃的变的材料，所能提供的材料只是数量的增加和积累，所揭露的事物本质的深度也只是在细胞水平。面对这种现实，一些生理学家以为，电生理黄金时代已经结束，是该退出生理学霸主位置的时候了。自从Patchclamp技术问世后，一些生理学家预言：电生理科学寿命自身延长几十年。

Patchclamp的成就是生理学界的一次技术革命。众所周知，诺贝尔奖历来是授予科学上有巨大意义的项目，一旦获得了诺贝尔奖，当然就表明了这一科学成果的学术价值和它的世界影响。Patchclamp技术对生理学的影响，就如同当年电子微显镜对形态学发展带来的影响一样巨大，一样富有带动性。微电极、电压钳和细胞内记录使生理学由器官水平发展为细胞水平，今天的Patchclamp技术将把生理学由细胞水平推进到分子水平。这是真正靠生理学手段建立的生理学自身专业的分子水平的技术。

三、心脏电生理研究简史心脏是血液循环的动力器官，它的活动以机械作功为主，但这种作功是以满足机体任何时候对血供的需要为前提的，因而心脏的活动必须是一种有节律的持续不断的活动。节律性兴奋的发生及其传播就是控制心脏持续作功的指令活动及信息传递。这种信息的发生及传播，在心脏中主要是以电学活动表现出来。对心肌细胞进行电生理学研究，是探讨心脏兴奋的发生及其传播的最主要手段。如今翻开心脏生理学、药理学以及其些心脏病的发病机制和治疗的著作，如果离对心脏电生理学、对心肌细胞的离子通道与离子流的理解，那将难以读懂。

对于心脏电活动的研究可以追溯到100多年前。

1858年，Kallicher和Miiller将神经肌肉标本的神经干搭在搏动的心脏表面，看到肌肉标本与心脏一起节律性地收缩，心脏每收缩舒张一次，肌肉标本也收缩舒张一次。揭示心脏的电变化刺激了神经，使神经产生兴奋并传至肌肉标本，引起肌肉收缩。然而这必竟是属于推测。

1873年，Waller和Lippmann用发明的水银毛细管电位计(CapillayElectrometer)观测了心脏的动作电流。

1879年和1883年，Burden、Sanderson和Page把一个电极放在蛙及龟的心室表面，将另一个电极放在已经损伤的心尖部位。将两个电极连到毛细管电位计上，于是就记录到心肌的动作电位，与现在的记录结果相似。

1883年，记录到心肌单相动作电位。

1903年，荷兰医学家Einthoven用自己发明的弦线电流计准确地记录了人体心电图，开创了心电图临床应用的光辉纪元。为此荣获1924年诺贝尔奖。

1936年，Goldenberg和Rothberger用悬线电流计记录出狗Purkinje纤维的自发性电活动。

1949年，是首次在心肌细胞内记录出电活动的一年。在美国，与Ling一起的J.Wwoodbury，L.Woodbury兄弟俩用琼脂将蛙在位心脏覆盖住，以限制其活动，成功地用微电极插入心肌细胞，得到了RP和AP。在英国，瑞士学者Weidman和从法国来的Coraboeuf在Hodgkin的实验室用微电极在狗的“伪腱”上记录了细胞内电活动。从此，开始了心肌电生理学研究的新纪元。

1951年起，Weidmann等人应用玻璃微电极技术直接记录单个心肌细胞电活动，并研究了不同类型的心肌细胞电生理特性，阐明了普通心肌及特殊心肌的不同电学特性及跨膜电位特性，为人们认识和理解体表心电图现象以及各种心脏病理生理和心脏药理机制开辟了新途径。

1950年，Woodbury用悬浮微电极记录是在位法的最早报道。

美国：1950年，Fuoters从剑桥大学带着英国的经验到了美国纽约州大学Hoffman实验室，Granefield从威斯康星，Suckling从新西兰来到Hoffman实验室。此后Hoffman实验室成了心肌电生理学研究一个中心。

英国：Weidmann在Hodgkin实验室建立了心肌电生理学基地。以后Vaughan、Williams在牛津大学、Hutter在Glasgow分别建立了两个实验室。

德国：Trautwein向Weidmann学习后，开创了德国的心肌电生理学研究。

法国：曾与Weidmann学习共事的Coraboeuf建立了法国心肌电生理研究中心。

日本：Woodbury于50年代初，作为原子能委员会统计员到日本工作，将电生理学技术带给Irisawa。1953年，日本的Matsuda到纽约Hollmann的实验室学习后，将技术带回日本。

1964年，鉴于心肌细胞太小而分支又多的特点，Trautwein和Hutter等建立了研究浦肯野纤维膜电位的双微电极电压固定技术（double-microelectridevoltageclamptechnique)。Stampfli又建立了适用于心房肌和心室肌膜电位的研究的单蔗糖间隙（singlesucrosegap）和双蔗糖间隙（doublesuerosegap）电压钳制技术。

1968年，Noble对浦肯野纤维膜电位的离子动力学问题作了综述。

膜片钳技术的出现，使心肌电生理学研究出现新的飞跃发展，证实了以往许多理论上的推测。

四、国内心肌电生理研究简史我国的心肌电生理学研究开展较晚。20世纪30~40年代，冯德培研究了神经肌肉接头传递进行了研究。张香桐关于树突功能，皮层神经元及视觉系统电生理研究。解放后，中科院上海生理所建立了神经电生理实验室。1960年，生理所办了第一期电生理训练班。1962年，上二医开办了第一期电生理学习班。70年代，我国运用电生理技术进行针麻研究。1980年，建立了中科院上海脑研究所。

70年代末期，上海生理所范世藩等首先用微电极记录了豚鼠心肌AP，研究了常咯啉抗心律失常作用的电生理特性。

北京大学刘泰摓教授，同济医大李少如教授相继开展工作。80年代：北大，上二医（徐有秋教授）、同济、西安医（李孝光）、山西医（赵荣瑞、河北医大（何瑞荣）、四医大（金嘉步）、南开大（解景田）、哈医大（杨高扬）、白求恩医大（江岩）、泸州医、中山医（陈培隽）、阜外医院（王芳平）、南京医（朱思明）、广州医（刘传芳）等开展了抗心律失常药的研究。

北大（触发性电流动、低温生理）、南京医学院（窦房结）、上二医（浦氏纤维）、泸医（比较生物学）。浮置微电极同济医大、西安医大、北大、山西医、哈医大、泸医、广州医。培养心肌电生理白求恩医大、中医研究院、泸医。

1．新技术的突破是打破科学处于停滞状态、使之跃入一个新的发展阶段的巨大动力。Hodgkin和Huxley的细胞内微电极记录技术使电生理由观察电现象阶段跃入了研究膜学说的新时期并创立了现代膜学说；Patchclamp技术使停滞多年的电生理进入了一个新的辉煌时期。Patchclamp技术提供了观察离子运动单一孔道动态变化过程，直接记录到单一孔道的电流变化，为在分子水平上了解离子跨膜运动提供了直接证明。这一方法的成功及细节上的改进，解决了电生理发展中面临的困惑，也为解决围绕这些困惑提出的种种假说提供了判断标准。技术突破给理论的发展带来了勃勃生机。是科学假说向真理过渡的根本条件。

2．新技术的突破是旧技术长期积累的结果，是把旧技术积累基础上的构想简化与可操作化的结果。科学发展是一条连绵不断的流动之河，新技术的诞生既是理论发展的需要，也是旧技术不断改进以及各种技术交叉、移植的产物。Patchclamp是借用了电压钳中膜固定原理和线路是显而易见的。它所用的电极也是微电极技术上的改进。是昔日电生理技术的发展。同时也包括对电生理技术以外其他技术的利用，如高温物理技术、酶技术、计算机技术等。

重大技术的诞生一般不会是连续的，它会有一个周期，其周期的长短无疑是由一个技术的生命力来决定的，也就是前一个技术还能不能解决有关领域的假说。如果它已不能验证新假说，提出新理论，此时，这个技术的生命就结束了，当“江郎才尽”