第三节 多肽和蛋白质类药物的生产

第三节多肽及蛋白质类药物提取法生产胸腺素提取法生产胰岛素提取法生产胸腺素1966年Goldstein等首次报道从小牛胸腺中提取了部分纯化的胸腺素，1972年进一步纯化分离得到一组具有免疫活性的多肽，称胸腺素F5（即从小牛胸腺提取得到的第5种组分），并可提供临床使用。药理作用与临床作用促进T淋巴细胞分化成熟。（1）临床上主要用于治疗细胞免疫缺陷疾病，如胸腺发育不良、重症联合性免疫缺陷症、多次感染综合症等；（2）肿瘤化疗和放疗并用胸腺素可使细胞免疫应答增强，从而加强化疗和放疗的抗肿瘤效果。胸腺素具有增强细胞免疫功能和调节免疫平衡等作用。用于治疗细胞免疫缺损性疾病，如胸腺发育不全、重症混合性免疫缺乏症、运动失调性毛细血管扩张症、麻风、重症感染、复发性口疮等伴有细胞免疫功能低下的患者。亦可用于病毒性肝炎、恶性肿瘤和抗衰老。提取法生产胸腺素胸腺素的结构与性质胸腺素是几十种多肽组成的混合物，相对分子量在1万以下；等电点在3.5～9.5；为了便于不同实验室对这些多肽的鉴别和比较，根据它们的等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名，共分三个区域：

α区：3.5～5.0

三个区域β区：5.0～7.0γ区：7.0～9.5胸腺素对热稳定，短时间内加热至80℃，其生物活性不降低。提取法生产胸腺素——提取工艺路线小牛胸腺

[预处理]

去脂肪和结缔组织，绞碎

胸腺碎块

[盐析]

0.9%NaCl-0.5%辛醇

提取液

[过滤]

纱布过滤

上清液(F1)

上清液(F2)

[除杂蛋白]80℃，冷却上清液(F3)

25%硫酸铵沉淀(F4)[盐析]

25%硫酸铵上清液

[除杂]

溶解，离心洗脱液[提取]

SephadexG-150[色谱分离]洗脱液G-25[脱盐]

胸腺素（F5）[干燥]

冷冻干燥提取法生产胸腺素——工艺说明工艺过程a．预处理：去脂肪，绞碎b．提取：生理盐水（盐水溶液），匀浆，离心（组分1）c．除杂蛋白：加热，60℃，离心（组分2）d．纯化：分段盐析

pH=7.0磷酸盐缓冲液，硫酸铵饱和度0.25，上清液（组分3）调pH=4.0，硫酸铵饱和度0.5，盐析物（组分4）除杂

0.1MTris-HCl缓冲液（pH=8.4）溶解，4000×离心30min

色谱分离凝胶层析SephadexG-150柱，第3个峰（葡聚糖凝胶，分离范围5,000～300,000）脱盐凝胶层析SephadexG-25柱，第1个峰（分离范围1000～5000）e．干燥：冷冻干燥（组分5）提取法生产胸腺素——工艺说明工艺讨论（1）除加热步骤外，所有步骤应在0～4℃下进行。（2）组分4过SephadexG-150柱时，在276nm波长检测共有4个吸收峰，胸腺素活性位于第3个峰。进一步SephadexG-25柱脱盐，共有2个吸收峰，胸腺素活性位于第1个峰。提取法生产胰岛素1、功能和来源（1）功能调节血糖浓度，治疗胰岛素依赖性糖尿病。

1965年，我国完成了世界上第一个人工合成蛋白质——牛结晶胰岛素的全合成工作。（2）来源胰脏中胰岛β细胞（胰岛中包括α细胞、β细胞、γ细胞）分泌的一种蛋白质激素。1965年9月17日，我国在世界上第一次人工合成了一种具有生物活性的结晶蛋白质——胰岛素，从而表明我国在多肽和蛋白质合成方面的科学技术已在世界上居先进地位。这种胰岛素是经过几年的艰苦努力，由中科院生化所、有机化学所和北大化学系合作，在王应睐和汪猷领导下合成成功的。提取法生产胰岛素2、结构与性质（1）结构由A链、B链通过2个二硫键连接而成。（2）性质①白色或类白色结晶粉末。②相对分子量：牛5733，猪5764，人5784。③胰岛素在pH=4.5～6.5范围内几乎不溶于水。④在弱酸性水溶液或混悬在中性缓冲液中较为稳定。胰岛素的分子模型提取法生产胰岛素猪胰[刨碎]

胰片[浓缩]

乙醇,草酸提取液

[碱化]

氨水pH8～8.4碱化液酸化液[酸化]硫酸pH3.6～3.8浓缩液减压蒸发去脂溶液[去脂]

速热速冷盐析物[盐析]

NaCl,pH2～2.5滤液[提取]

水、丙酮,氨水pH4.2～4.3[酸化]沉淀氨水,乙酸锌,pH6[锌沉淀]

胰岛素精品

[碱化][结晶]

柠檬酸、乙酸锌、丙酮，氨水,pH8,过滤调pH6结晶

[洗涤][干燥]水,丙酮、乙醚；真空干燥37℃2h提取法生产胰岛素工艺过程方法：酸醇法和锌沉淀法（1）提取：酸醇法（2）碱化、酸化：除碱性蛋白、酸性蛋白（3）浓缩：30℃以下，减压浓缩（4）去脂、盐析：去除脂类、分开杂蛋白（5）酸化、锌沉淀：除酸性蛋白（6）碱化、锌沉淀：除碱性蛋白（7）洗涤、干燥：胰岛素成品■质量鉴定——多肽和蛋白质含量测定

1、凯氏定氮法（GB/T5009.5-2003）蛋白质是含氮的有机化合物，与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数（6.25），即为蛋白质含量。

2、紫外分光光度法即利用蛋白质在280nm处的的吸收峰，以标准蛋白质为参考，检测其中的蛋白质含量。质量鉴定——多肽和蛋白质含量测定

3、福林-酚试剂法（Lowry法）蛋白质（或多肽）分子中含有酪氨酸或色氨酸,能与Folin-酚试剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，蓝色的深浅与蛋白质浓度成正比，可用比色法测定蛋白质浓度。

４、考马斯亮兰法（Bradford法）

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。质量鉴定——多肽和蛋白质纯度测定

1、电泳均一性测定在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。电泳已日益广泛地应用于分析化学、生物化学、临床化学、毒剂学、药理学、免疫学、微生物学、食品化学等各个领域。

2、超速离心（ultracentrifugation）在超速离心机中，应用强大的离心力分离、制备、分析物质的方法。超速离心机的离心速度为每分钟60000转或更多，离心力约为重力加速度的500000倍，可分成制备性超速离心机和分析性超速离心机两大类。两者均装有冷冻和真空系统。制备性超速离心机容量较大，主要用于分离制备线粒体、溶酶体和病毒等以及具有生物活性的核酸、酶等生物大分子。分析性超速离心机另装有光学系统，可以监测旋离过程中物质的沉降行为并能拍摄成照片。质量鉴定——多肽和蛋白质纯度测定

3、可结晶性物质从液态（溶液或溶融状态）或气态形成晶体的过程叫做结晶。结晶操作不仅能够从溶液中取得固体溶质，而且能够实现溶质与杂质的分离，借以提高产品的纯度；同时也是纯度的检验方法，因为只有相对较纯的蛋白溶液才能形成结晶。

4、蛋白质功能及免疫抗原性测定检测蛋白质的生物学活性，由此判定该蛋白的纯度。通过检查抗原抗体反应也可以判定蛋白质的纯度，因为蛋白是典型抗原，不同蛋白质的抗原反应不同。要求：1.具有强烈的工作责任心和领悟力。2.生物、生化、医药、化工、生物技术相关专业，大专以上学历。3.制药行业质量保证岗位3年以上的工作经验。4.熟悉中国、WHO、美国和欧盟GMP及相关法规。5.了解生物制药的工艺、工程与质量检验。6.有起草制订质量保证体系文件与药厂GMP认证的经验。7.能熟练运用计算机和常用软件；英文熟练，包括听说读写。白蛋白及人血丙种球蛋白人白蛋白:

目前人白蛋白的生产工艺为“低温乙醇法”经不同浓度的乙醇反复沉淀所得，最终产品还须经60℃10小时的专项病毒灭活，经验证该产品有可靠的安全性，国内外至今尚无使用该产品而感染HIV、HBV、HCV等报道。特性、结构和功能特性白蛋白又称清蛋白，是人血浆中含量最多的蛋白质，约占血浆总蛋白的35%，人白蛋白对人体无抗原性。人血丙种球蛋白，属于一类糖蛋白，也称为免疫球蛋白，主要存在于血浆中，具有抗体活性。免疫球蛋白占血浆总蛋白的20%。对酸较稳定，其耐热性要强于血浆中其他蛋白，在高温下，白蛋白容易发生聚合，氧化钠或脂肪酸盐可提高白蛋白的热稳定性结构白蛋白为单链，含有575个氨基酸残基，相对分子质量为65000，其N末端为天冬氨酸，C末端为亮氨酸，可溶于水和半饱和硫酸铵溶液，一般在60%的硫酸铵饱和度时析出沉淀。功能在临床上，白蛋白主要用于维持血浆胶体渗透压，用于失血性休克、严重烧伤、低蛋白血症等；人丙种球蛋白则主要用于被动免疫，可预防流行性疾病，如病毒性肝炎、脊髓灰质炎、风疹、水痘和丙种球蛋白缺乏症。白蛋白制备工艺过程及控制要点（1）将人血浆泵入不锈钢夹层反应釜内，开启搅拌，用Na2CO3，溶液调pH为8.6，再泵入等体积的2%利凡诺溶液，充分搅拌后静置2~4h，分离上清液（供生产丙种球蛋白用）与络合溶液。（2）解离溶液用无菌蒸馏水稀释，用稀盐酸调至弱酸性，加氯化钠0.15%~0.2%，不断搅拌进行解离。充分解离后，加热至65℃维持1h，立即用冷水冷却。（3）分离冷却后，解离液用篮式离心机分离，离心液再用不锈钢压滤器过滤。（4）超滤上述过滤液用超滤机超滤浓缩。（5）热处理浓缩液在60℃恒温处理10h，灭火病毒。（6）澄清和除菌以不锈钢压滤器澄清过滤，再用微滤除菌。