南方医大癌生物学讲义09-2 P53水平的调控

第九章（2）P53水平的调控“我们已经知道了，P53最终被认为是一个非常重要的抑癌基因。那么，机体是如何调节P53的激活、降解与稳定，进而发挥重要的作用呢？这其中涉及哪些信号与通路呢？”1、P53的激活信号20世纪90年代早期，科学家发现X射线、紫外线、某些能损伤DNA的化疗药、DNA合成抑制剂及分解细胞骨架中微管蛋白的因子能诱导P53蛋白水平快速升高。在接下来的几年里，低氧（缺氧）条件被发现能够引起P53水平剧烈改变。后来还发现，将myc或者腺病毒携带的E1A癌基因转入细胞后也能引起P53水平的上调。高于正常水平的E2Fl转录因子表达、染色体DNA的广泛去甲基化、DNA的核苷酸前体不足都能刺激P53的积累。将细胞置于一氧化二氮或者酸性培养基中、细胞内核糖核酸的缺失、RNA或DNA合成的阻碍也都可以使P53蛋白水平升高。

在其他研究中能导致P53上调的遗传毒性（如DNA损伤）因子及生理学信号同样被熟知，它们在某些条件下能抑制细胞生长，导致细胞循环停止，这种反应通常被称为“生长抑制”。在另一些情况下，这些应激信号可能启动凋亡程序。当遗传毒性因子，如X射线，诱发细胞内P53水平升高时，p21Cip1蛋白水平也相应地升高，然而在p53突变的细胞中则不发生这样的现象。这说明P53蛋白能通过诱导CDK抑制剂的表达来阻滞细胞周期进程。综合考虑，这些发现可以整合成一个简单的机制模型：P53持续地接收从多种监控系统传出的信号。如果P53接收到特殊的警报信号时，它将阻止细胞的增殖，或者启动凋亡程序。实际上，p53具有抑制细胞生长和促进细胞凋亡的功能，这对于那些向恶性生长期进展的初期肿瘤细胞来说是一个主要威胁。许多应激，包括缺氧、基因组损伤及调控细胞增殖的信号通路失调，是肿瘤细胞在发展成肿瘤的各个时期都会经历的。在这些应激中的任何一种存在的情况下，完整的、有功能的P53警报系统就会威胁可能形成肿瘤的细胞。2、DNA损伤及失调的生长信号导致p53稳定有3个研究的比较透彻的监控系统，当检测到损伤或者信号失衡时，会给P53发送报警信号。第一个监控系统是对染色体DNA双链断裂(DBS)进行应答的，这些断裂是由电离辐射引起的，如X射线。传感器将信号传递给ATM激酶，ATM将信号传递到Chk2激酶上。Chk2激酶能磷酸化P53,

而P53的磷酸化保证其中被一个名为Mdm2的蛋白质降解。（下节讨论）

第二条信号通路可以被单链DNA(ssDNA)激活，单链DNA是由停滞的复制叉产生的，通常是由于DNA聚合酶遇到了因DNA损伤而改变的碱基。这些DNA损伤因子包括某些化疗药物及紫外线照射。ssDNA感应器通过Chk1激酶激活ATR激酶，进而使P53蛋白磷酸化，从而保护其不被降解。第三条通路是由异常的生长信号引起的P53激活，特别是在那些由于pRb-E2F控制的细胞周期发生紊乱时，这条通路并不依赖于激酶介导的P53水平的改变及信号。这些错综复杂的信号通路说明了哺乳动物细胞的脆弱。在进化的进程中，P53蛋白被委以重任，接收来自负责监控许多重要的细胞内生理及生化系统发出的信号。但这也给细胞带来了一个最大的弊端

，即一旦失去这个调控通路的蛋白质，细胞将灾难性地失去监控自身健康的能力，并且将不能对某些系统的失灵采取适

当的对抗措施。图9-2-1：P53的激活信号和下游效应在一次打击后（实际上，两次打击能使P53基因的两个拷贝失活），细胞变得对

自身的故障开始视而不见。由此它们获得了在某些环境下持续增殖的能力，而在正常情况下这些环境会导致细胞增殖抑制或者进入凋亡。另外，失去了由P53促进的DNA修复及稳定基因组的功能，p53-/-细胞的子代将获得更多的突变

，并且在向形成恶性肿瘤的道路上更快地迈进。3、Mdm2参与降解P53像许多细胞蛋白一样，p53蛋白是由泛素蛋白酶体系统降解的。由这个系统降解的蛋白质都会首先被多聚泛素链共价标记结合，然后被转运到蛋白酶体中，并在其中被消化成为寡肽。这个过程中最为关键的一步是起始的标记过程。在正常的、未被搅乱的细胞中，p53的降解是由蛋白Mdm2（小鼠中）和MDM2（人）调控的。

p53作为一个转录因子起作用，Mdm2与p53结合后立即使其调节转录的功能失活。此后，Mdm2介导单个泛素与p53的连接，并将其从核内（p53主要在核内起作用）转运到细胞质中，接下来对p53的多聚泛素化保证了其在细胞质蛋白酶体中的迅速降解。连续而有效的Mdm2运作保证了p53在正常未受应激的细胞中有20min短暂的半衰期。以上讨论仅显示了Mdm2作为一个单体蛋白发挥作用，而实际上它常与MdmX（又称Mdm4）形成异源二聚体。这个复合物在泛素化导致p53降解的过程中发挥主要作用。实际上，在缺失Mdm4的情况下，Mdm2不能使p53降解。图9-2-2：Mdm2控制P53水平：在某些生理信号刺激后P53浓度上升（此处未显示），P53

四聚体与众多的靶基因启动子区结合，这些靶基因的转录由P53诱导（上）。在这些基因中，还包括mdm2,

导致mdm2mRNA及Mdm2蛋白水平的上升（右）。一旦合成，Mdm2分子就和P53蛋白亚基结合，并使其泛素化，并被转运至胞质中进一步泛素化（此处未显示），随后在蛋白酶体中降解。这个负反馈环保证了P53最终回落到一个较低的水平，并且在正常细胞中保证P53的浓度在一个非常低的水平在某些环境下，特别是细胞遭遇某些类型的应激或者损伤时，p53必须被保护起来，以免除Mdm2对它们的降解。一般来说，这种保护通常是通过磷酸化来实现的，Mdm2不能与磷酸化的p53结合，故不能使其泛素化。p53的磷酸化氨基酸残基位于N端结构域，如ATM、Chkl和Chk2等激酶对该位点的磷酸化，改变了p53蛋白中通常被Mdm2识别并结合的结构域，通过这个方式避免Mdm2与p53结合。同时，DNA损失诱导激活的ATM激酶可以磷酸化Mdm2,

并使其功能失活并解体。当p53和Mdm2都被磷酸化后，Mdm2不能起始p53的泛素化。从而使得p53不被降解。图9-2-3：p53蛋白与Mdm2的结合发生在其靠近N端的一个小的结构域中，而它的转录激活区也在此处。在此区域内的p53氨基酸残基的磷酸化（红色棒棒）阻止了与Mdm2的结合并使得p53不能被泛素化及降解Mdm2蛋白的活性及其水平由其他信号调节。这个信号通路使细胞在激活Pl3激酶(Pl3K)

通路后，通过Akt/PKB激酶引起Mdm2的磷酸化，将Mdm2从细胞质中转入核中，并在核中与p53发生作用。由于Pl3K本身由Ras和生长因子受体激活，我们了解到促有丝分裂信号通路确实可以影响Mdm2从而影响p53。同时，在促有丝分裂信号通路中，Ras-Raf-MAPK的激活能通过Ets

AP-I(Fos+Jun)转录因子大幅提高mdm2基因的转录，产生高水平的mdm2

mRNA及蛋白质。提高的

Mdm2蛋白水平通过

PI3K-Akt/PKB信号通路增加了磷酸化激活的Mdm2。这些效应都导致了p53蛋白水平的降低。另外一个影响Mdm2的机制通过Mdm2拮抗物的发现而被发现，即小鼠细胞中的p19ARF和人类中的p14ARF。精确的序列分析发现了后来被命名为ARF的基因。这个编码基因最早在小鼠细胞中被发现，它的序列与p16INK4A基因重叠。后者是

CDK4和CDK6激酶的一个重要抑制剂，可起始pRb

的磷酸化。通过使用p16INK4A启动了上游13kb处的启动子转录及可变剪切，使该基因合成了一个编码可变阅读框的mRNA，其编码ARF蛋白。在野生型咽齿类动物细胞中表达ARF编码的cDNA,

可以对细胞增殖产生强有力的抑制作用。但是，当将ARF的cDNA

转入到缺少野生型p53功能的细胞中时，这种抑制作用却没有发现。这说明ARF的生长抑制功能完全依赖于细胞中有功能的p53的存在。

进一步的研究发现，在野生型细胞中，ARF的表达可以导致p53水平的快速上调。现在已经研究清楚了ARF与Mdm2结合并抑制其功能这个反应的分子机制，一方面它可以将Mdm2