叶辉临床8版-20章-常用分子生物学技术的原理及其应用150104课件

常用分子生物学技术的原理及应用

常用分子生物学技术的原理及应用第一节分子杂交与印迹技术

第一节分子杂交与印迹技术核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理核酸分子杂交(nucleicacidhybridiza1、印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。1、印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。2、探针技术NC膜DNA或RNA探针用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多叶辉临床8版-20章-常用分子生物学技术的原理及其应用150104课件第二节PCR技术的原理与应用ThePrincipleandApplicationof

PCRTechnology第二节PCR技术的原理与应用末代沙皇尼古拉II

1918年的流行性感冒病毒

电影《侏罗纪公园》

辛普森杀妻案PCR

的故事末代沙皇尼古拉IIPCR的故事上述四件事情到底有什么相关呢？

然而近三十年来生物技术的一项新发明，把它们给连在一块了。这项技术就是“聚合酶链反应”（polymerasechainreaction，PCR）

答案是NO!

上述四件事情到底有什么相关呢？

PCR最大特点是能将微量DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。

PCR最大特点是能将微量DNA大幅增加。因此，无论是化

PCR的发明人，一般公认是穆里斯（K.Mullis），他因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。

KaryBanksMullisPCR的发明人，一般公认是穆里斯（K.Mullis）thePacificCoastHighwayPCR的点子，据穆里斯的说法，那是在1983年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段DNA反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。thePacificCoastHighwayPCR的点变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C循环25~30次使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引物之间存在的局部双链得以消除使引物和模板DNA退火结合此温度下DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA链的延长三个步骤为一个循环，每次循环产物作为下一轮模板进入下一轮循环1.PCR的基本反应步骤一、PCR技术的工作原理变性延伸退火循环使模板DNA完全变性成单链。同时引物自身和引模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+2.PCR体系基本组成成分黄石公园的热泉1973年台湾科学家钱嘉韵从黄石公园热泉里一种嗜热菌中成功分离出耐高温的TaqDNA聚合酶。

Thermusaquaticus模板DNA2.PCR体系基本组成成分黄石公园的热泉1973年第一轮循环5/3/3/5/5/5/5/5/引物A引物B变性（95℃）6075859590807065555045403530℃退火（60℃）延伸（72℃）DNA-PolDNA-Pol温度3.PCR技术的工作原理第一轮循环5/3/3/5/5/5/5/5/引物A引物B变性（第二轮循环5/5/5/3/3/5/5/5/引物A引物B6075859590807065555045403530℃变性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）5/5/5/5/温度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol第二轮循环5/5/5/3/3/5/5/5/引物A引物B607第三次循环5/5/5/5/5/5/5/6075859590807065555045403530℃5/变性（95℃）退火（60℃）延伸（72℃）温度DNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-PolDNA-Pol25～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上第三次循环5/5/5/5/5/5/5