核酸的定量测定课件

核酸的定量测定紫外吸收法核酸的凝胶电泳定磷法二苯胺法地衣酚法紫外吸收法

实验原理

核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。试剂和器材试剂：钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。

材料

酵母RNA干粉。

1.准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/LNaOH调成糊状,再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。2.取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min。3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。RNA=A260/A280=2.0操作方法

二、计算公式

ΔA260

RNA浓度=xN0.024xL

式中，ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值；L──比色杯的厚度，1cm；

N——为稀释倍数；0.024──每毫升溶液内含1μgRNA的A值；1mL待测样品液中核酸（微克）核酸％＝1mL待测样品液中制品的毫克数在本实验中，1mL待测液中制品量为50μg。1.紫外分光光度计使用前要预热。2.比色皿应成套使用，注意保护,不能拿在光面上。3.离心机使用前必须将离心管平衡，对称放置。调速必须从低到高，离心完等转子完全停下后，再打开盖子，然后将转速打到最低。注意事项

是当前核酸研究中最常用的方法。有许多的优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。核酸的凝胶电泳（一）琼脂糖凝胶电泳用于大片段DNA或RNA的分离，精度低，但分离范围广。电泳迁移率决定于：（1）核酸分子的大小（迁移率与相对分子质量对数成反比）（2）胶浓度（迁移率与胶浓度成反比，常用0.7～1%）（3）DNA的构象：超螺旋＞线状分子＞开环状分子（4）电压（一般5V/cm,电压与迁移率成正比)（5）碱基组成（影响不大）（6）温度（4～30℃都可以，常室温进行）

琼脂糖凝胶电泳常用于DNA分析；分析RNA时需加入蛋白质变性剂甲醛。电泳完毕用溴化乙锭（0.5μg/mL）染色，用紫外光检测★琼脂糖电泳用于DNA分子量的测定在同一凝胶中加入已知相对分子质量的样品（分子marker)，在电泳完成后，通过染色，照相，从照片上比较待测样品的DNA片段与标准样品中的已知大小片段，可以推测待测未知DNA片段的分子大小。用于小片段DNA的分析相对分子质量小于1000bp的DNA片断和RNA的电泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析时不会分解样品。（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）定磷法二、实验原理在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物——钼蓝。2.钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用维生素C为还原剂时，测定的最适范围为1-10微克无机磷。测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量。RNA的理论含磷量为9.5%，故由所测的核酸含磷量可计算出核酸含量。

消化的RNA溶液(0.06mg/mL)：取0.6mg酵母RNA，加入1.5MH2SO4溶液10mL，在沸水浴中加热10-20分钟，使核酸充分水解后，用于对各组分的鉴定。

未消化的RNA溶液(0.06mg/mL):

取0.6mg酵母RNA,加入蒸馏水10mL，55-65度消化半小时。三、实验步骤

1.取同样规格的试管8支，按下表顺序分别精确地加入各试剂。编号12345678标准磷溶液10ug/mL(mL)0.000.200.400.600.801.000.000.00水(mL)3.002.802.602.402.202.002.002.00定磷试剂3.003.003.003.003.003.003.003.00消化的RNA(0.06mg/ml)0.000.000.000.000.000.001.000.00未消化的RNA(0.06mg/ml)0.000.000.000.000.000.000.001.00相当于无机磷量(微克)0.002.004.006.008.0010.00AB将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温30-45分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定OD(光密度)值。以1-6号管标准磷含量（微克）为横坐标，光密度为纵坐标，绘出标准曲线。二苯胺法二、实验原理脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖（五碳糖）也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。编号1234567DNA标准液(200ug/mL)0.000.400.801.201.602.000.00蒸馏水(mL)2.001.601.200.800.400.000.00二苯胺试剂(mL)4.004.004.004.004.004.004.00DNA待测液(mL)0.000.000.000.000.000.002.00DNA含量(ug)080160240320400YOD595X三、实验步骤

1.取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精确地加入各试剂。将试管内溶液立即摇匀，于70℃恒温水浴内保温50-60分钟。取出冷却至室温，于595nm处测定OD值。以1-6号管DNA含量（微克）为横坐标，光密度为纵坐标，绘出标准曲线。根据7号管测得的OD值，从标准曲线求出DNA待测液中的DNA含量。地衣酚法二、实验原理当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖转变成醛类，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大光吸收。RNA浓度在20—250μg/ml范围内，光吸收与RNA浓度成正比。

地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。试管试剂/ml0123456RNA待测溶液0.00.00.00.00.00.03.0标准RNA溶液(100ug/ml)0.00.61.21.82.43.00蒸馏水3.02.41.81.20.60.00地衣酚-Fe3