HIV-1的分离培养的方法和用途_第1页
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文档简介

1、HIV-1的分离培养的方法和用途1 范围本章规定了HIV1体外分离培养的方法和用途。 适用于对人血液和其他样本中HIV的分离培养。规范性引用文件NIAID，Virology Manual for HIV Laboratory, NIH Publication, No.97-3828.Jan 19973 HIV-1分离的意义3.1 HIV抗体不确定或HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。3.2 HIV表型耐药检测及其他HIV生物学特征的研究。3.3 HIV 感染的辅助诊断HIV-1感染窗口期。4 实验室要求4.1 实验室：经过认可的生物安全3级实验室。4.2 设备：生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒

2、置显微镜、离心机（配水平转头）、压力蒸汽灭菌器、液氮罐、-80冰箱、酶标仪等。4.3 材料：HIV阴性者抗凝全血、淋巴细胞分离液、细胞培养液（RPMI1640）、胎牛血清、白细胞介素-2（IL-2）、植物血凝素（PHA）、HIV-1P24抗原检测试剂或逆转录酶检测试剂。细胞培养瓶、细胞培养板、吸管等。5 HIV-1分离的方法及程序一般采用靶细胞（HIV阴性者外周血淋巴细胞，PBMC）与受检者标本（PBMC、全血、血浆、精液及其他体液）共培养的方法，最常用的方法是PBMC共培养。5.1 样本：首选新鲜抗凝全血，也可以使用血浆、精液及其他体液。5.2 靶细胞制备：取HIV阴性者的抗凝全血，采用密度

3、梯度离心的方法分离PBMC，并在含有适量天然白介素-2（IL-2）和植物血凝素（PHA-P）的培养基中培养3天，使淋巴细胞由静止状态充分活化。5.3 建立共培养：将靶细胞与待检样本混合，在合适的条件下培养，培养过程中适时换液或补加新鲜靶细胞，维持培养28天。5.4 监测病毒生长：定时取适量培养上清液，检测HIV-1P24抗原或逆转录酶活性。也可定期观察细胞的形态，看有无HIV特征性的合胞体或其他细胞病变。5.5 病毒鉴定：取培养上清液提取纯化RNA，或取共培养的PBMC提取纯化基因组DNA，用PCR方法扩增HIV-1特征性基因片段，对扩增阳性的片段进行基因序列测定。5.6 判定结果和解释5.6

4、.1 培养上清液P24抗原或逆转录酶连续2次呈阳性反应、并有P24抗原含量/逆转录酶活性升高，或同时出现HIV特征性细胞病变，并经鉴定为HIV 基因序列，判为HIV-1分离阳性。5.6.2 培养上清液P24抗原或逆转录酶始终为阴性，判为HIV-1分离阴性。5.6.3 HIV-1分离培养阳性可以确证为HIV-1感染，分离培养阴性不能排除HIV-1感染。6 质量保证和质量控制6.1 技术人员应接受HIV分离培养技术操作和生物安全3级实验室使用的专门培训，掌握基本的细胞培养技术。6.2 必须在生物安全3级实验室的生物安全柜内操作，使用塑料的细胞培养瓶和吸管，遵守生物安全操作规程。6.3 受检者样本必须无菌，培养过程中注意无菌操作。6.4 制备靶细胞时使用多人PBMC混合、去除受检

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