基因工程-2课件

1、基因工程技术曹月青重庆大学生命科学学院1第三章 基因工程的常用载体2主要内容载体的功能及特征质粒（plasmid）噬菌体 M13噬菌体考斯质粒（cosmid）与噬菌粒人造染色体载体3作用一：作为运载工具，将外源基因转移 到受体细胞中去。作用二：为外源基因提供复制能力或整合 能力作用三：为外源基因的扩增或表达提供必 要的条件（一）载体的作用4作为运载体必须具备哪些条件？1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）高效率的进入宿主细胞3）具多个单一限制酶切点，以便与外源基因连接。4）具有较高的外源DNA的载装能力。5）具有某些标记基因，便于进行筛选。6）容易从宿主细胞分离出来，便于后续体外操作5细胞

2、内独立的能够自我增殖的结构单位为复制子；包括与复制控制有关的结构和与复制控制无关的 结构； 细菌的染色体是一个复制子，而真核生物染色体是 多个复制子的复合体。7可自然形成超螺旋，大小在2-300kb。还有开环（ocDNA）和线状两种状态。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用（不同于线粒体）。 是基因工程最常用的运载体。8 抗药性包括：氯霉素（Cm），氨苄（Ap） 氯霉素（Cm）；卡那（Km）；链霉素（Sm）对金属离子抗性砷（As3+），汞（Hg2+），镍（Ni2+）银（Ag+）10（1）自主复制性 是能独立复制的复制子。质粒DNA复制的质粒可随宿主的分裂传给下一代。 3、质粒的基本特征1

3、1 根据复制的控制和每个细胞中的拷贝数多寡，质粒可分为两大复制类型：严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid ）：复制与宿主的繁殖相耦联，受寄主复制起始蛋白控制， 1 - 3 拷贝松弛型复制控制的质粒（relax plasmid ）： 复制不与宿主的繁殖相耦联，几十至几百拷贝（2）可扩增性12 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。14 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒能在天然条件下自发地从一个

4、细胞转移到另一个细胞（接合作用），如含F因子质粒等； 非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用； 目前在基因工程实验室中常用的质粒属于此类。（4）可转移性154、质粒改造构建 天然质粒往往存在不同程度的缺陷，因而不适合用作 基因工程的载体必须对之进行改造构建： （1）具有复制起始点 具有复制子的功能，且起始区域没有所需的酶切位点。 （2）加入合适的选择标记基因 如两个以上，易于用作选择。 （3）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 17（4） 分子量尽可能小 缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率， 增加装载量（5） 改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （6） 应为非传递性质粒1

5、85、质粒的分类 人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒 装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆表达质粒 装有强化外源基因表达的转录翻译、纯化的元件探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选196、实验室常用质粒优点：1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。2、具有两种抗菌素抗性基因可供

6、转化子的选择记号。3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。pBR32220 特点： 1）分子量小，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。 2）抗性和蓝白筛选,易于 检测。 3）多克隆位点区（MCS）.pUC系列21 半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ） 半乳糖苷酶基因有1021 AAs。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。 这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码

7、。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。 蓝白筛选原理22半乳糖苷酶基因的优点: a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZ编码5-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性 c. lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大24pUC衍生载体T7和SP6启动子可进行体外转录25T7 promoter：T7 特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等。原核表达载体277、 质粒DNA的分离纯化 最常用的方法为碱裂解法

8、 原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 用此方法制备的质粒较纯，收得率高，但繁琐， 且质粒中有开环现象。 28 图1 图2超螺旋环状线状29质粒大小应以线性状态做判断6kb 1 2 3 4 5 6 71、2、3、5：单一酶切位点4：两个酶切位点7：未酶切质粒30 分子量，拷贝数多 为内切酶提供切点的机会小 容易提取质粒载体的优缺点优点 克隆片段小，小于10kb缺点31 噬菌体是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主

9、复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来。 （二） 噬菌体1、噬菌体介绍32温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体（双链）烈性噬菌体：只有溶菌生长周期的噬菌体33 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA组成-DNA全长48502个核苷酸-DNA上至少有61个基因（必要，非必要基因）2、 噬菌体生物结构34 线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端），称为cos区。353、噬菌体感染周期36噬菌体的包装374、 噬菌体的溶原状态 噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代

10、噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。 人们可以根据需要改变-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态。 DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态 。 381）缩短长度2）删除多余的酶切位点3）加装选择标记4）构建琥珀型密码子突变体5、-DNA载体的构建策略39插入型载体由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。DNA中缺失部分部分非必要基因，只含有一个供外源基因插入的酶切位点的DNA载体。40取代型载体* 36-51 kb为包装的上下限 DNA的可替换片段两端具有两个酶切位点，酶切后替换片段与带有所有必需基因的左右两臂分开，由外源DNA片段取代。41选择标记

11、与质粒不同，野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是-DNA克隆载体构建的重要内容。 -DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记42 加装选择标记imm434（免疫功能插入失活） imm434基因编码一种阻止-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， -重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。这种形态学上的差异，为分离重组体提供了方便的标志。43 插入失活：外源DNA克隆到插入型载 体上，会使噬菌体的某种生物功能丧失 效力，即所谓的插入失活效应

12、。44lacZ（ -半乳糖苷酶插入失活） lacZ基因编码-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能降解X-gal，不能合成蓝色化合物，形成无色空斑；而空载 体-DNA则产生蓝色透明斑。454）构建琥珀型密码子突变体 琥珀型突变（sup) ：是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。 将野生型-DNA上两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散。 基因工程实验中用的菌株含有特异性的校正基因，

13、其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。46 -DNA重组分子需在体外人工包装成有感染 力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬 菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。6、-DNA重组分子的体外包装47 这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分： 一部分缺少头部的 E组份， 另一部分则缺少头部的D组份。 包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。488、-DNA及其重组分子的分离纯化 1. 大肠杆菌培养至对数生长期 2. 加

14、入-噬菌体悬浮液， 37培养1小时 3. 用新鲜培养液稀释，继续培养4-12小时 4. 高速离心，沉淀噬菌体 5. 酚抽提，释放-DNA 6. 乙醇或异丙醇沉淀DNA499、 -DNA作为载体的优点：-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量重组-DNA分子的筛选较为方便重组-DNA分子的提取较为简便-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因50 -DNA载体的装载量最大为25 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，柯斯质粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。 柯斯质粒(cos

15、 site-carrying plasmid) 就是含有 -DNA两端cos区和质粒复制子的杂种质粒载体。 （三）柯斯质粒1、柯斯质粒的定义51 由于-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端（cos）附近的一小段顺序，均1.7kb长，通过特异切割体系，将多联体分子切割，然后进行包装。 2、构建柯斯质粒载体的思路52 将噬菌体DNA中与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建柯斯质粒载体的思路。53 与噬菌体DNA不同的是：柯斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞。相同的是：可体外包装，具有感染性。 与质粒相同的是：柯斯质粒具有质粒的复制子，能象质粒一样在宿主体内进行复制。它的制备与质粒相同。不同的是兼有噬菌体的某些性质。54 可以装载比质粒或 -DNA大得多的外源DNA 片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长 为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载47kb的 外源DNA。装载量大55 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时柯斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要