CHAPTER 5 原核基因表达调控课件

1、原核基因表达调控Regulation in prokaryotesChapter 5OUTLINE5.1 原核基因表达调控总论5.2 乳糖操纵子的转录调控5.3 色氨酸操纵子的转录调控5.4 其它操纵子(半乳糖、阿拉伯糖)5.5 翻译水平的调控一、基因表达的概念gene expression ：基因转录及翻译的过程。对这个过程的调节就称为gene regulation 。注意：rRNA、tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达。5.1原核基因表达调控总论(1) 组成性表达(constitutive expression) 指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达。其

2、基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的，且较少受环境因素的影响。 (2) 适应性表达(adaptive expression) 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。二、基因表达的方式(1) 组成性表达 指不大受环境变动而变化的一类基因表达。某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(housekeeping gene)。管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。5.1 原核基因表达调控总论基因调控主要表现在：转录水

3、平上的调控(Transcriptional regulation)转录后水平上的调控(post-Transcriptional regulation)mRNA加工成熟水平上的调控翻译水平上的调控基因调控的主要水平阻遏作用：一些基因平时都是开启的，处在蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。例如：色氨酸色氨酸合成酶。一般情况下细菌自身可以合成色氨酸，但加入色氨酸，细菌因为不需要自身合成色氨酸，因此关闭该操纵子基因。5.1.1 诱导和阻遏原核基因表达调控类型及特点负转录调控(调节基因的产物为阻遏蛋白)正转录调控(调节基因的产物为激活蛋白)负控诱导(阻遏

4、蛋白不与诱导物结合，结构基因不转录)负控阻遏(阻遏蛋白与诱导物结合，结构基因不转录)正控诱导(诱导物使激活蛋白处于活性状态)正控阻遏(诱导物使激活蛋白处于非活性状态)原核生物的基因调控主要发生在转录水平1. Gene Expression is Controlled by Regulatory Proteins (调控蛋白)Gene expression is very often controlled by Extracellular Signals, which are communicated to genes by regulatory proteins:Positive regula

5、tors or activators(激活蛋白)INCREASE the transcriptionNegative regulators or repressors(阻遏蛋白)DECREASE or ELIMINATE the transcription3.Targeting promoter binding: many promoters are regulated by activators that help RNAP bind DNA (recruitment) and by repressors that block the binding.RNAP binds many prom

6、oters weakly, activators that contain two binding sites to bind a DNA sequence and RNAP simultaneously can enhance the RNAP affinity with the promoters, and thus increases gene transcription.This is called recruitment regulation (招募调控). On the contrary, Repressors can bind to the operator inside of

7、the promoter region, which prevents RNAP binding and the transcription of the target gene.5.Targeting promoter escape by some repressorsRepressors can work in ways: blocking the promoter binding. blocking the transition to the open complex. blocking promoter escape.6. Cooperative binding (recruitmen

8、t) and allostery have many roles in gene regulationFor example: group of regulators often bind DNA cooperatively (activators and/or repressors interact with each other and with the DNA, helping each other to bind near a gene they regulated) : produce sensitive switches to rapidly turn on a gene expr

9、ession, integrate signals (some genes are activated when multiple signals are present).5.1.2 弱化子对基因活性的影响弱化子：(色氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸等)当操纵子(是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制)被阻遏，RNA合成被终止时，起终止转录信号作用的一段核苷酸。核糖体在基因转录产物上的不同位置，决定了RNA可以形成哪一种形式的二级结构，并由此决定基因能否继续转录。起信号作用的是有特殊负载的氨酰-tRNA的浓度。5.1.3 降解物

10、对基因活性的调节通过提高转录强度来调节基因表达：葡萄糖效应(降解物抑制效应)：在有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其相对应的操纵子也不会启动，不会产生出代谢这些糖的酶来。葡萄糖：抑制腺苷酸环化酶，减少cAMP的合成，与其相结合的环腺苷酸受体蛋白CRP或分解代谢物蛋白CAP，找不到配体而不能形成复合物。5.1.4 细菌的应急反应实施应急反应的信号是鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)；产生这两种物质的诱导物是空载tRNA。当氨基酸饥饿时，细胞中存在大量空载tRNA，其激活焦磷酸转移酶，使ppGpp大量合成，从而关闭和打开一些基因

11、。1961年操纵子模型的提出 莫洛(Monod)和雅各布(Jacob)获1965年诺贝尔生理学和医学奖 是一种负控诱导系统5.2 乳糖操纵子(lactose operon)真正的诱导剂？IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)TMG(巯甲基半乳糖苷)发色底物O-硝基半乳糖苷(ONPG)别乳糖和IPTG是Lac操纵子的诱导物Lac 操纵子结构Operon: a unit of prokarytoic gene expression and regulation which typically includes: 1. Structural genes for enzymes in a specific b

12、iosynthetic pathway whose expression is coordinately controlled. 2. Control elements, such as operator sequence. 3. Regulator gene(s) whose products recognize the control elements.Sometimes are encoded by the gene under the control of a different promoterlacYencodes a cell membrane protein called la

13、ctose permease (半乳糖苷渗透酶) to transport Lactose across the cell walllacZencodes for -galactosidase(半乳糖苷酶)for lactose hydrolysislacA encodes a thiogalactoside transacetylase (硫代半乳糖苷转乙酰酶)to get rid of the toxic thiogalacosides 三种结构基因The lacZ, lacY, lacA genes are transcribed into a single lacZYA mRNA (p

14、olycistronic mRNA) under the control of a signal promoter Plac . LacZYA transcription unit contains an operator site Olac position between bases -5 and +21 at the 3-end of PlacBinds with the lac repressor The LAC operonZ、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码；该mRNA分子的P区位于I与O之间，不能单独起始半乳糖苷酶和透过酶基因的高效表达。5.2.2 操纵子模型

15、与影响因子O区是DNA上的一小段序列(26bp)，是阻遏蛋白的结合位点；当阻遏蛋白与O相结合时，lac mRNA的转录起始受到抑制；诱导物通过与阻遏蛋白结合，改变其三维构象，使之不能与O结合，从而激发lac mRNA的合成。5.2.2 操纵子模型与影响因子1.lac 操纵子的本底水平表达两个矛盾：诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，即需要透过酶来转运诱导物，而透过酶的合成又需要诱导物进行诱导。乳糖(葡萄糖-1,4-半乳糖)并不与阻遏物结合，真正的诱导物是乳糖的异构体(葡萄糖-1,6-半乳糖)，而后者是在-半乳糖苷酶的催化下由乳糖生成的，因此乳糖诱导-半乳糖苷酶的合成需要有-半乳糖苷酶的预先存

16、在。对矛盾的解释：在非诱导状态下有少量lac mRNA合成，这种合成称之为本底水平的组成型合成(background level constitutive synthesis)。由于阻遏物的结合并不是绝对紧密的，即使在它与操纵基因紧密结合时，也会偶尔掉下来，这时启动子的障碍被解除，RNA聚合酶开始转录。（即:无需诱导物，阻遏物从操纵基因处掉下，启动子可以启动结构基因表达）1.lac 操纵子的本底水平表达2.大肠杆菌对乳糖的反应加入乳糖以后，在单个透过酶分子作用下，少量乳糖分子进入细胞，在单个-半乳糖苷酶作用下转变为异构乳糖。异构乳糖与结合在O区的I相结合并使I失活而离开O区，开始lac mRN

17、A的合成，最终结果导致乳糖大量涌入细胞。ipozyaVery low level of lac mRNAAbsence of lactoseActivePresence of lactoseipozyab-GalactosidasePermeaseTransacetylaseInactiveLack of inducer: the lac repressor block all but a very low level of trans-cription of lacZYA .When Lactose is present, the low basal level of permease al

18、lows its uptake, and b-galactosidase catalyzes the conversion of some lactose to allolactose.Allolactose acts as an inducer, binding to the lac repressor and inactivate it. Response to lactose3.阻遏物lacI基因产物及其功能lac操纵子阻遏物mRNA：由弱启动子控制组成型合成，该阻遏蛋白有四个相同的亚基，每个亚基含有347个氨基酸残基，并能够与1分子IPTG结合。当I基因由弱启动子突变为强启动子，细胞内

19、就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些突变体中就不可诱导，结构基因处在关闭状态。Response to glucose，cAMP受葡萄糖浓度调节4.葡萄糖对lac操纵子的影响代谢物激活蛋白CAP (catabolite activator protein)，由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。凡是Crp及腺苷酸环化酶基因突变的细菌都不能合成lac mRNA，CRP-cAMP (CAP-cAMP)复合物是独立于阻遏物的正调控因子。5.cAMP与代谢物激活蛋白CAP结合位点(mRNA启动子内部)ZYAOPDNA 调控区CAP结合位点启动序列操纵序列 结构基因Z： -半

20、乳糖苷酶Y： 透酶A：乙酰基转移酶cAMPCAP复合物5.cAMP与代谢物激活蛋白+ + + + 转录无葡萄糖，cAMP浓度高时促进转录有葡萄糖，cAMP浓度低时不促进转录ZYAOPDNACAPCAPCAPCAPCAPCAPCAP的正调控两个区：P区(启动子区)：一般是从I基因结束到mRNA转录起始位点下游510bp。O区(阻遏物结合区)：位于-7+28bp阻遏物与O区的结合影响了RNA聚合酶与启动子区结合形成转录起始复合物的效率。5.2.3 lac操纵子DNA的调控区域总结一：阻遏蛋白的负性调节(negative control of repressor)无乳糖(no lactose): l

21、ac操纵子处于阻遏状态(repression)有乳糖(presence of lactose) lac操纵子即可被诱导(derepression,induction) 诱导剂(inducer): 别乳糖、半乳糖、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）乳糖操纵子(lac operon)的调控方式总结二：CAP的正性调节(Positive Control of CAP)CAP-cAMP帮助RNA聚合酶有效的结合到lacP位点，加快RNA合成的起始反应：RNA聚合酶与CAP相互足够靠近，直接复合，以蛋白质-蛋白质接触提供额外的能量，大大增强RNA聚合酶的结合能力；CAP的结合可能把位点周围的DNA双螺旋结构

22、转变为一种更容易被RNA聚合酶识别的外形和构象，增加了封闭复合物的形成或者从封闭型复合物转向开放型复合物的速度。CAP以二聚体形式行使功能，二聚体被单个cAMP活化，其上有两个结合位点：cAMP结合位点；DNA结合区(lacP内CAP-cAMP结合位点序列具有对称性，lacP的-54-58,-65-69是CAP-cAMP结合位点) 。总之：CAP-cAMP复合物与DNA的CAP位点结合时，促进RNA聚合酶对-35和-10序列的识别和结合，并形成开放起始复合物，提高了转录效率。总结二：CAP的正性调节(Positive Control of CAP)CAP的正性调节CAP的正性调节5.3色氨酸操

23、纵子(tryptophan operon)Lac操纵子负责营养碳源的分解，平时关闭，只有当需要消耗乳糖时，才通过诱导物使阻遏蛋白失活而开放，是可诱导的负调控基因；另外还存在CAP的正调控。Trp操纵子负责Trp的合成，平时开放，调节基因的产物使其关闭，是可阻遏的负调控；另外还存在翻译与转录耦联的衰减子调控手段。Trp操纵子与lac操纵子的不同1.Structure of the trp operonED-编码邻氨基苯甲酸合成酶(260KD)C-编码吲哚甘油磷酸合成酶(45KD)BA-编码Trp合成酶亚基(50KD)和亚基(29KD)La为前导肽和衰减子序列O为控制子(含-10区)P为启动子R为

24、阻遏基因1.Structure of the trp operon (1) trpR和trpABCDE不连锁； (2) 操纵基因在启动子内 (3) 有衰减子(attenuator)/弱化子 (4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被前导序列(Leader)所隔开 色氨酸操纵子特点The trp operon encodes five structural genes required for tryptophan (色氨酸) synthesis.These genes are regulated to efficiently express only when tryptophan is li

25、miting.Two layers of regulation are involved: (1) transcription repression by the Trp repressor (initiation); (2) attenuation2. the trp operonTrp repressor is encoded by a separate operon trpR, and specifically interacts with the operator that overlaps with the promoter sequence The repressor can on

26、ly bind to the operator when it is complexed with tryptophan. Therefore, Try is a co-repressor and inhibits its own synthesis through end-product inhibition (negative feed-back regulation).3.The Trp repressorThe repressor reduces transcription initiation by around 70-fold, which is much smaller than

27、 the binding of lac repressor.The repressor is a dimer of two subunits which has a structure with a central core and two flexible DNA-reading heads (carboxyl-terminal of each subunit )3.The Trp repressortrp operonThe TRP operontrp 操纵子的阻遏系统低Trp时：阻遏物不结合操纵基因；高Trp时：阻遏物与Trp结合操纵基因色氨酸高浓度和低浓度下表达水平相差600倍，而阻遏

28、作用仅使转录降低70倍。 a regulation at the transcription termination step & a second mechanism to confirm that little tryptophan is available4.Attenuation (衰减作用)Repressor serves as the primary switch to regulate the expression of genes in the trp operonAttenuation serves as the fine switch to determine if the

29、 genes need to be efficiently expressed4.Attenuation (衰减作用)弱化子：DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列（123-150区）研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点结构基因E上游具有：启动子-操纵子基因-前导序列-衰减子区域mRNA5端162个核苷酸，其中139个构成前导序列：14个氨基酸的前导肽4个互补区段1个衰减子终点Trp操纵子的前导序列TrpL前导序列：在trp mRNA5端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段某些区段富含GC，GC之间容易形成茎环

30、二级结构，接着有8个U构成一个不依赖于因子的终止信号；由(1)和(2)区序列构成第二个发夹结构，其中(1)区处于14个氨基酸的前导肽序列中；(2)和(3)区互补，可以形成发夹结构，与(3)和(4)形成发夹结构竞争；14个氨基酸前导肽中有5个核糖体强结合位点，之后还有一个UGA；前导序列中并列2个色氨酸密码子前导序列的5个特点转录的弱化理论：mRNA转录的终止是通过前导肽基因的翻译来调节的。在前导肽中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对tRNATrp的浓度敏感。当培养基中Trp浓度很低时，负载有Trp的tRNATrp也就少，翻译通过两个相邻Trp密码子的速度就会很慢，当4区被转录完成时，

31、核糖体才进入1区(或者停留在两个相邻的Trp密码子处)，这时23配对，不形成34配对的终止结构，转录继续。当培养基中Trp浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻的Trp密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使23不能配对，34区形成终止子结构，转录停止。转录弱化作用机理转录弱化作用机理Importance of attenuation A typical negative feed-back regulationUse of both repression and attenuation allows a fine tuning of the level of the intracell

32、ular tryptophan.Attenuation alone can provide robust regulation: other amino acids operons like his and leu have no repressors and rely entirely on attenuation for their regulation.Provides an example of regulation without the use of a regulatory protein, but using RNA structure instead.半乳糖操纵子阿拉伯糖操纵

33、子阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答二组分调控系统和信号转导多启动子调控的操纵子5.4其它操纵子结构基因(使半乳糖变为葡萄糖-1-磷酸)：galE：异构酶galT：半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶galK：半乳糖激酶调节基因galR，两个启动子(可以从两个不同的起始点转录)，两个操纵区O(一个在P区上游-67-73，一个在galE内部)5.4.1半乳糖操纵子(galactose operon)gal操纵子的特点： 它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录； 它有两个O区，一个在P区上游，另一个在结构基因galE内部。gal操纵子P-O区有两个相距仅5bp的启动子，每个启动子拥

34、有各自的RNA聚合酶结合位点S1和S2，cAMP-CRP对起始的转录有不同的作用：从S1起始的转录：无葡萄糖，RNA聚合酶与S1的结合需要半乳糖、CRP和cAMP。从S2起始的转录：完全依赖葡萄糖，高水平的cAMP-CRP抑制转录。5.4.1半乳糖操纵子(galactose operon)半乳糖具有双重功能：作为唯一碳源；作为合成尿苷二磷酸半乳糖UDPgal形成细胞壁的前体。在没有外源半乳糖的情况下，细胞通过半乳糖差向异构酶由UDP-葡萄糖合成UDPgal，只需本底水平表达即可。如果只有S1(依赖于cAMPCRP)一个启动子，当有葡萄糖时就不能合成异构酶；只有S2(不依赖于cAMPCRP)，那

35、么半乳糖使操纵子处于充分诱导状态。最终：一个不依赖cAMPCRP的S2进行本底水平的表达，一个依赖于cAMPCRP的S1对高水平合成进行调节。双启动子的生理功能阿拉伯糖降解基因(构成基因簇araBAD) ：araB：编码核酮糖激酶araA：L-阿拉伯糖异构酶araD：L-核酮糖-5磷酸-4-差向异构酶araE：膜蛋白araF：阿拉伯糖结合蛋白5.4.2阿拉伯糖操纵子arabinose operon与araBAD相邻的是：一个复合启动子区域、两个操纵区(O1和O2)、一个调节基因araC。araBAD基因簇从启动子开始向左转录，而araC向右转录。AraC蛋白既是ara操纵子的正调节蛋白(起始转

36、录还需要cAMP-CRP的共同参与)，又是其负调节蛋白。AraC蛋白的两种形式Pr和Pi， Pr是起阻遏作用的形式，与类操纵区位点结合； Pi是起诱导作用的形式，通过与PBAD启动子结合进行调节。5.4.2阿拉伯糖操纵子arabinose operon低阿拉伯糖水平负调控高阿拉伯糖水平正调控1. AraC and control of the araBAD operon by anti-activationThe promoter of the araBAD operon from E. coli is activated in the presence of arabinose and th

37、e absence of glucose and directs expression of genes encoding enzymes required for arabinose metabolism. This is very similar to the Lac operon. Because the magnitude of induction of the araBAD promoter by arabinose is very large, the promoter is often used in expression vector. If fusing a gene to

38、the araBAD promoter, the expression of the gene can be easily controlled by addition of arabinose.What is an expression vector ? 1. AraC and control of the araBAD operon by anti-activationaraC表达受到AraC的自身调控。AraC既是ara操纵子的正调节蛋白（需cAMP-CRP的共同参与，起始转录），又是其负调节蛋白。这种双重功能是通过AraC蛋白的两种异构体来实现的（Pi和Pr)。ara操纵子的调控有两个特点当细菌DNA遭到破坏时，细菌会启动SOS的诱导型DNA修复系统，参与SOS DNA修复系统的基因受LexA阻遏蛋白的抑制。当DNA严重受损时，DNA复制被中断，单链DNA缺口数量增加，RecA蛋白与缺口处单链DNA相结合，被激活成为蛋白酶，将LexA蛋白切割为没有阻遏和操纵区DNA结合活性的两个片段，导致SOS体系高效表达，DNA得到修复。5.4.3 阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答SOS反应的机理：由RecA蛋白和LexA阻遏物的相互作用引起的。LexA阻遏物：是SOS DNA修复系统所有基因的阻遏物。RecA蛋白：