蒋2016秋-基因诊断与基因治疗课件

1、蒋小英 生物化学与分子生物学系西 安 交 通 大 学 医 学 部 基 础 医 学 院 第二十五章 基 因 诊 断 和 基 因 治 疗 一、基因诊断的主要对象和样品来源 二、基因诊断的技术三、基因诊断的临床应用第一节 基因诊断 基因诊断： 是以DNA或RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断检测的分子也可以是蛋白质或多肽。 一 基因诊断的主要对象和样品来源 基因诊断的内容定性和定量分析基因序列分析基因突变分析基因拷贝数分析基因表达产物分析外源基因检测基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性 二 基因诊断常用的分子生物学技术核酸

2、分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips） Western免疫印迹（Western blotting） 免疫组织化学诊断 （ Immunohistochemistry ）（一）核酸分子杂交1）. RT-PCR 指在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时PCR( real time PCR)2）. 荧光定量PCR荧光标记引物

3、3）. 多重PCR 多重PCR示意图 A：普通PCR；B：多重PCR该方法是诊断已知点的突变：需分别合成野生型和突变型探针在基因诊断时，只需用PCR扩增受检者目的DNA片段，再分别与上述探针杂交4）. PCR-ASO Allele specific oligonucleotide,ASO等位基因特异性寡核苷酸分子杂交 PCR-ASO N：正常基因；H：杂合子基因；M：突变基因ASO1ASO2NHM（三）单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism, SSCP） DNA突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链DNA后在中性聚丙烯酰胺凝胶中

4、的构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。 SSCP特别适于分析小于400bp的PCR产物。可以区分1bp的差异。 PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，电泳后还需测序分析。PCR-SSCP分析原理示意正常人纯合突变杂合突变+ PCR-SSCP分析 设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列，在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物，根据电泳后酶切片段长度变化，即可作出诊断。PCR-RFLPABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C +DAEcoR 限制性内切酶位点的变化左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因

5、诊断研究（六）生物芯片（biochips）基因芯片（gene chips）蛋白质芯片(protein chip)（一）.对致病基因的直接诊断 清楚基因突变与疾病之间的分子机制（二）.通过连锁遗传标志的间接诊断 许多基因病，基因结构未阐明，但已定位在染色体的特定位置上，通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来诊断。 一.对致病基因的直接诊断 清楚基因突变与疾病之间的分子机制 1 基因缺失或插入的诊断 2 点突变的诊断 3 动态突变的诊断 4 基因表达异常的诊断一.对致病基因的直接诊断1 基因缺失或插入的诊断方法Southern杂交斑点杂交原位杂交跨断裂点的PCR(裂口PCR,gap-PCR)So

6、uthern印迹检测片段缺失A:正常个体B:缺失纯合子C:缺失杂合子BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe -珠蛋白生成障碍性贫血的直接基因诊断-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同类型的-珠蛋白生成障碍性贫血缺失片段20kb5/5/3/3/RFLP或PCR-RFLP （1）有限制性内切酶位点改变一.对致病基因的直接诊断2 点突变的诊断前提条件：多数点突变不是酶切位点 主要方法PCR-ASO （Allele specific oligonucleotide,ASO） 等位基因特异性寡核苷酸分子杂交 RDB （Reverse dot blot） 反向点杂交DHPLC （Dena

7、ture high performance liquid chromatography） 变性高效液相色谱 PCR-SSCP （ single-strand conformation polymorphism, SSCP） 单链构象多态性分析AS-PCR (Allele specific PCR) 等位基因特异PCR ,PCR产物直接测序（2）无限制性酶切位点改变 PCR-ASO 合成野生型和突变型探针 PCR扩增受检者目的DNA片段，与上述探针杂交结果： PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交-不 存在这种突变； 只与突变探针杂交-突变基因为纯合子； 与正常探针和突变探针都可杂交-突

8、变基因为杂合子； 与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发现的类型正常探针突变探针A 正常B 突变纯合子C 突变杂合子反向点杂交(reverse dot blot,RDB)将针对各种突变和正常序列的ASO探针固定在杂交膜上,而将原来在ASO杂交体系中固定在膜上的PCR产物改为液相进行杂交,这种立法称为反向点杂交.同时检测多种突变，如地中海贫血。囊性纤维化变性高效液相色谱（denature high performance liquid chromatography, DHPLC）利用PCR扩增过程的单链DNA产物可以随机与互补链相结合而形成双链的特性,依据最终产物中是否会出现异源双链

9、来判断待测样品中是否存在点突变.一.对致病基因的直接诊断3 动态突变的诊断短串联重复(STR) 拷贝数的增加导致某些遗传病发生,称为动态突变.方法:PCR直接扩增诊断基于STR的DNA片段长度多态性如脆性x染色体综合征;5端CGG重复序列 正常人拷贝数5-50 症状前携带者50-200 患者超过200，片段过长无法扩出 mRNA的相对定量分析 mRNA的绝对定量分析 mRNA长度分析一.对致病基因的直接诊断4. 基因表达异常的检测连锁分析(linkage analysis)利用与致病基因相连的某些基因作为遗传标志,通过鉴定遗传标志的存在与否判断是否带有致病基因.优点无需更多了解致病基因结构及其

10、分子机制缺点间接诊断,没有直接检测基因突变二.通过连锁遗传标志的间接诊断1 连锁分析的遗传标志特点不同个体之间存在高度的多态性需要获得足够数量的家系成员样本标记基因与致病基因相连锁人类基因组上的DNA遗传标记 限制性片段长度多态性(RFLPs )1985 短串联重复序列 (short tendem repeats, STRs ,mini- satellites )1990s 单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymor-phisms SNPs) RFLPs由于DNA 变异产生新的酶切位点或原有的酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量的片段。 主要

11、用于一些基因较大且突变类型不清楚的单击因遗传病的诊断。 PCR-RFLP7.6kb13kb患者正常 镰状红细胞贫血的间接基因诊断 -珠蛋白RFLP标记的连锁分析Hap7.6kb13kbSouthern印迹杂交N H PN：正常；H：杂合子；P：患者（纯合子）；黄色区域为探针HapHapHapSTRs短串联重复序列 STR广泛存在于人基因组，总数约有5-10万个，个体之间的STR互不相同，能够稳定遗传基本单位2-4bp的串联重复，主要形式为： (CA)n ， (GA)n ， (AA)n ， (GG)n ，(CAA)n， (CGG)n ，其中以 (CA)n ， (GT)n 为多见。1992年，We

12、lssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。扩增片段长度多态性(AFLP,Amp-FLP)通过PCR技术,扩增致病基因内部或两侧与其紧密连锁的特定STR,经电泳检测扩增片段长度多态性,实现基因诊断的方法.定义: 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。 人类基因组有300多万个SNP位点，平均每5001000个碱基对中就有1个。 SNPs单核苷酸多态性 基于SNP的单倍型分析指基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基,其中最少的一种在群体中的频率不小于1%.SNP可以确定个体的疾病易感性和药物反应性.以SNP单倍型（多位点SNP 分析）为

13、遗传标志，结合家系分析推断疾病.三 基因诊断的医学应用（一）遗传性疾病的诊断和风险预测（二）多基因常见病的预测性诊断（三）传染病病原体检测（四）疗效评价及用药指导（五）DNA指纹鉴定与法医学个体识别遗传性疾病诊断和风险预测基因诊断目前可用于遗传筛查和产前诊断。 疾病致病基因突变类型诊断方法地中海贫血珠蛋白缺失为主Gap-PCR、DNA杂交、DHPLC地中海贫血珠蛋白点突变为主反向点杂交、DHPLC甲型血友病凝血因子点突变为主PCR-RFLP乙型血友病凝血因子点突变、缺失等PCR-STR连锁分析苯丙酮尿症苯丙氨酸羟化酶点突变PCR-STR连锁分析、ASO分子杂交 马凡综合症原纤蛋白点突变、缺失P

14、CR-VNTR连锁分析、DHPLC我国部分代表性常见单基因遗传病基因诊断 DNA指纹与法医学诊断个体识别和亲子鉴定： DNA指纹技术是从基因水平检测DNA的高度多态性，个体识别率高。以往在刑事案件的法医学鉴定中应用的是血型、血清蛋白型、红细胞酶型和HLA分型，个体分辨能力不够，只能排除，不能做到统一认证。亲权鉴定与DNA指纹图由此图可推断出：A和C是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；D为养女。 基因诊断知识点一览图第二节 基因治疗 （gene therapy） 是指改变人遗传物质为基础的生物医学治疗模式。通过一定方式将人正常或野生型（wild type）基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞

15、以矫正或置换致病基因的治疗方法。一、基因治疗的基本策略二、基因治疗的基本程序三、基因治疗的临床应用现状 一、基因治疗的策略 （一） 缺陷基因精确的原位修复 （二） 基因增补 （三） 基因沉默或失活 （四） 自杀基因治疗 （五） 基因免疫治疗 （一）缺陷基因精确的原位修复 基因矫正（gene correction） 基因置换（gene replacement） 定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，用正常的基因置换染色体上的原有的缺陷基因。 但目前技术还不能达到理想的效果。 （二）基因增补 基因添加（gene augmentation） 类型:在缺陷基因的细胞中导入正常基因，而缺陷

16、基因并未除去，通过正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。基因添加（gene augmentation）或称基因增补是 目前基因治疗的主要策略。（三）基因沉默或失活 定义：有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的，向患者体内导入有抑制基因表达作用的核酸，如反义RNA、核酶、干扰小RNA等，可降解相应的mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。这一策略称为基因失活（gene inactivation）或基因沉默（gene silencing）。 定义：将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码

17、的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。应用：是恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy) 单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。1.自杀基因系统2. 旁观者效应（bystander effect） “自杀基因”导入后，不仅使转导了“自杀基因”的肿

18、瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。 （五）基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。 选择治疗基因选择携带治疗基因的载体 选择基因治疗的靶细胞将治疗基因导入人体治疗基因表达的检测二、基因治疗的基本程序（一）.治疗基因的选择 细胞内的基因在理论上均可用于基因治疗。可有针对性地进行选择。 只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么,就可用其对应的正常基因做治疗用的基因.基因治疗中的病毒载体：反转录病毒载体腺病毒载体腺相关病毒载体单纯疱疹病毒载体（二）选择携带治疗基因的载体 载体：病毒载体和非病毒载体两大类

19、 常用病毒载体结构adeno-associated virus vectorRetrovirus vectorAdenovirus vectorHerpes simplex virus vectorLTRLTRgenegeneITRITRpAgeneITRITRpAgenepacorigenegenegenegeneComon used Virus vectors 包装细胞(packaging cell) 是经过特殊改造的细胞，已经转染和整合了病毒复制和包装所需要的辅助病毒基因组（缺陷型病毒），可以完成病毒的复制和包装。 病毒载体的基因转移效率较高，是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的

20、临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是反转录病毒载体。反转录病毒的结构及生活周期（1）反转录病毒 两端各有一长末端重复序列LTR。 反转录病毒前病毒的结构特点 LTR由U3、R和U5三部分组成。病毒有三个结构基因5端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（）及剪接供体位点(SD)和剪接受体位点(SA)。 含有负链DNA转录的引物结合位点(PBS)和正链DNA转录的引物结合位点。在U3内有增强子和启动子； U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； 在R内还有poly(A)加尾信号。 gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原；pol基因，编码反转录酶；env基因，编码病毒外壳或

21、包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。 Retroviral packaging system反转录病毒的制备反转录病毒载体介导的基因治疗流程治疗基因克隆到反转录病毒载体中筛选包装细胞转化细胞培养从上清中获得重组病毒颗粒并纯化之感染靶细胞反转录病毒载体的优缺点优点基因转移效率高细胞宿主范围广泛DNA整合效率高缺点1 安全性问题会重组产生有感染性病毒的可能随机整合可能使原癌基因激活或抑癌基因失活 2 容量较小，只能容纳7 kb以下的外源基因。 （2）腺病毒(adenovirus)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞进入细胞，然后转移至细胞核内，保持在

22、染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。 人的腺病毒50多个血清型，c亚类2型、5型（Ad2和Ad5）在人体不治病，适合做基因治疗载体。 腺病毒的优点基因导入效率高，不整合，对人类安全；基因转导与细胞分裂无关；重组病毒可口服经肠道吸收、喷雾吸入或气管内滴注；腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。目 录缺点不能整合，分裂增殖快的细胞，重组病毒载体随分裂丢失的机会增多，表达时间相对较短。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。（3）腺病毒相关病毒载体 一类单链线状DN

23、A缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒等）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。AAV Virus Particles AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具反转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。 目 录AAV优点 AAV载体的缺陷 AAV载体容量小，目前最多只能容纳5 kb外源DNA片段；感染效率比反转录病毒载体低,在40%80%的成人中存在过感染;可能会引起免疫排斥。常用基因治疗载体整合致病性感染细胞克隆容量反转录病毒 载体随机整合，效率高可能致病分裂细胞7kb腺病毒载体不整合，可能丢失不致病分裂细胞、非分裂细胞腺相关病毒载体定点整合(19号染色体特定区域)不致病分裂细胞、非分裂细胞5kb7.5kb成功用于基因治疗的靶细胞 靶 细 胞优 点缺 点造血干细胞自我更新能力和分化能力。最有前途的靶细胞之一。骨髓中含量低，难以获得足够的量皮肤成纤维细胞来源广