6流式细胞术的质量控制和影响因素

1、流式细胞术的质量控制和影响因素一、标本本的采集集和固定定方法的的质量控控制标本采集集是十分分重要的的环节，在标本的的采集过过程，需注意意：手术切除除的新鲜鲜标本或或活检针针吸标本本取材时时，要避免出出血坏死死组织。标本采集集后要及及时固定定或深低低温保存存，以免组织织发生自自溶，DNA降解，而造成测测试结果果的误差差。固定剂要要采用对对组织细细胞穿透透性强的的浓度。例如70%的乙醇固固定比75%以上的浓浓度固定定效果好好，因为高浓度的的乙醇常常造成细细胞表面面快速形形成一个个蛋白膜膜，致使细胞胞内的物物质固定定不良。 有作者分分析研究究了自溶溶对DNA测定的影影响，发现自溶溶的组织织细胞常常出

2、现假假性异倍倍体，且不固定定的组织织细胞随随时间的的延长，DNA含量呈梯梯度降低低根据检测测的目的的，选择什么么类型的的固定剂剂，对流式检检测质量量也有显显著的影影响。例如细胞胞DNA的分析，使用醇类类固定剂剂较好而而不选择择醛类固定剂剂，醛类固定剂剂明显影影响细胞胞DNA荧光发射射强度。实验证明明，醛类固定剂剂对插入入性荧光光染料与与核酸的的结合有有很强的的干扰作作用，其荧光强强度仅相相当于新新鲜组织织荧光强强度的50-70%左右。如果作流流式免疫疫研究工工作，采用新鲜鲜组织是是最好的的选择。在不能及及时检测测又没有有低温保保存条件件时，要根据所所测物质质在细胞胞内还是是在细胞胞膜表面面，在

3、膜表面面的抗原原物质，以醛类固定剂剂为宜，尽管醛类固定剂剂产生的的非特异异性荧光光较强，但不宜采采用醇类类固定剂，因醇类固固定剂可可使细胞胞表面的的糖蛋白白、脂蛋蛋白脱落落丢失，失去标记记的位点点。 如所测抗抗原物质质在细胞胞内，可以使用用醇类固固定剂，这种固定定方法简简便易行行，无需特殊殊低温冷冷冻条件件，在一般冰冰箱(0-4)放置即可可，能很好的的保持细细胞形态态和生物物化学成成分不发发生变性性。二、单细细胞悬液液制备的的质量控控制 人体的末末梢血液液和骨髓髓细胞及及淋巴组组织是人人体组织织中缺乏乏细胞间间连结装装置的组组织，尤其是血血和骨髓髓细胞是是天然的的单分散散细胞材材料，其中的细细

4、胞成分分在生理理状态下下呈单分分散状态态，它是流式式分析最最合适的的样品来来源。 二、单细细胞悬液液制备的的质量控控制 全血中含含有多种种有形成成分，流式细胞胞检测是是以某一一群细胞胞为检测测对象，因此在检检测前须须将所测测的某群群细胞成成分分离离出来。例如，以淋巴细细胞DNA定量分析析为例，就须把淋淋巴细胞胞分离出出来，而将其他他有核细细胞或红红细胞去去除，对于血小小板的分分析样品品制备过过程中须须防止过过高离心心速度造造成血小小板膜的的损伤，出现血小小板凝集集新鲜实体体组织单单细胞样样品的制制备，实体组织织是流式式分析工工作的主主要材料料来源，但对其分分散单细细胞样品品的技术术和方法法，仍

5、存在着着很多问问题，仍需大量量的探索索工作。就目前，国内外对对实体组组织分散散单细胞胞还没有有找到一一个适用用的又通通用方法法，甚至同样样组织，用于不同同的实验验目的，就需要不不同的方方法处理理，或者每一一种组织织就是一一个单独独的问题题因此必须须根据实实际情况况，去选择合合适有效效的单分分散方法法，选用的方方法必须须达到细细胞产量量高，细胞损伤伤小的目目标，但实际工工作中达达到这个个目标是是困难的的，多年来对对于实体体组织的的分散解解聚多采采用酶学学法，化学法、机械物物理方法法以及低低渗脱核核方法等等，根据各种种组织的的特点，以及实验验目的的的不同，可选择不不同的方方法。选则酶学学方法时时，

6、应注意选择酶类类型的问问题，含有大量量结缔组组织的，选择胶原原酶好，不宜选择择胃蛋白酶或胰酶。并要注意意酶的活活性条件件和影响响因素，要注意酶酶的溶剂剂，消化时间间，pH值，浓度等对对酶活性性的影响响酶学方法法分散组组织都有有一定的的应用限限制，特别用于于流式免免疫荧光光实验时时，酶处理可可能改变变或丢失失膜的抗抗原成分分，从而影响响分析结结果，由于酶学学方法分分散下来来的细胞胞产量低低，用组织较较多，还要注意意酶的纯纯度，活性单位位，以及生产产厂家对对酶的污污染化学方法法，往往单独独应用分分散组织织效果不不理想，应与酶学学方法综综合使用用，分散效果果更佳。机械方法法，常采用剪剪碎，网搓研磨磨

7、，细针抽吸吸等，对细胞损损伤大，产生的细细胞碎片片多，细胞团块块多，在使用机机械法时时，要给于组组织适当当的压力力，这种适当当的压力力需要有有较多的的制样实实践经验验技术人人员来操操作。低渗方法法，其溶液是是一种低低渗液体体，造成细胞胞膜的破破坏，使细胞核核自行释释放出来来，是一个裸裸核悬液液样品，本方法简简便，但要避免免脱核时时间过长长，造成核膨膨胀碎裂裂。以上几种种方法是是目前对对实体组组织解聚聚常用的的方法，往往不是是单用，常常是一一种或二二种方法法的结合合使用，总的来说说，对实体组组织分散散为单细细胞还存存在很多多困难，因此还需需要深入入探讨流流式样品品的制备备技术，制备出完完整细胞胞

8、产量高高，细胞损伤伤小的合合格悬液液,获得更好好的流式式检测结结果。三、石蜡蜡包埋组组织单细细胞制备备的质量量控制 石蜡包埋埋组织标标本的材材料选择择，应经病理理医师仔仔细检查，选取无自自溶，坏死的组组织对肿肿瘤组织织标本，选取含肿肿瘤组织织细胞丰丰富的区区域，且经病理理形态或或细胞学学核实病病理诊断断三、石蜡蜡包埋组组织单细细胞制备备的质量量控制 切取适当当厚度的的石蜡组组织片，大量研究究证明，切取40-50m厚度的切切片是适适宜的，过厚的组组织片消消化费时时，消化下来来的细胞胞数少，过薄的切切片可产产生大量量的细胞胞碎片，影响检测测结果，使肿瘤异异倍体的的检出率率减少，我们研究究了石蜡蜡切

9、片不不同厚度度(5,10,20,30,40,50m)对流式分分析DNA的影响，发现较薄薄的切片片造成碎碎片较多多,噪音增加加,组方图的的基线提提高,影响倍体体分析的的精度在组织脱脱蜡的过过程中，一定将蜡蜡脱净，残留的石石蜡可影影响酶的的消化活活性，检查是否否将蜡脱脱净的方方法是弃弃去二甲甲苯，加入100%乙醇，如果无絮絮状物浮浮起，表示蜡已脱净净梯度酒精精(100%70%50%)水化要充充分,使组织还还原到与与新鲜组组织相似似的状态态。 消化酶液液要掌握握适当的的浓度、pH值、温度度等，不造成酶酶的活性性降低为为宜，消化时间间很重要要，时间短细细胞消化化不下来来，时间长，消化下来来的细胞胞又被

10、破破坏，在制备石石蜡包埋埋单细胞胞时，常规使用用0.5%胃蛋白酶酶（PH1.5）石蜡包埋埋组织的的单细胞胞制备方方法的建建立，使流式细细胞术在在医学研研究中得得到更广广泛的应应用，但仍存在在一些问问题有待待进一步步解决，主要存在在问题如如下：样品中的的碎片较较多，所测得的的DNA组方图质质量不及及新鲜组组织好，组方图的的峰位较较宽，CV值偏大。异倍体率率减少，由于组方方图细胞胞峰CV值较大，一些近于于二倍体体的DNA异倍体峰峰被掩盖盖石蜡包埋埋组织的的单细胞胞制备方方法的建建立，使流式细细胞术在在医学研研究中得得到更广广泛的应应用，但仍存在在一些问问题有待待进一步步解决，主要存在在问题如如下：

11、S期细胞百百分比不不如新鲜鲜组织的的S期计算精精确，S期细胞的的计算偏偏高，这仍然与与CV值较大有有关DNA二倍体标标准不稳稳定 Schutter等发现用用新鲜正正常组织织的二倍倍体细胞胞或者用用其他生生物细胞胞DNA含量(例如，鸡红细胞胞，鳟鱼血细胞胞等)作为石蜡蜡包埋组组织细胞胞DNA含量的标标准不适适用，石蜡包埋埋组织比比新鲜组组织细胞胞DNA荧光强度度低，且样品间间的荧光光强度不不稳定DNA二倍体标标准不稳稳定 对存档中中的石蜡蜡包埋组组织材料料，可以采用用正常组组织石蜡蜡包埋标标本，作为一个个外参的的二倍体体标准，但要求采采用的外外参二倍倍体样品品和肿瘤瘤样品中中加入内内标准样样品(

12、例如鸡血血细胞等等)四、脱落落细胞样样品的采采集脱落细胞胞样品的的采集要要保证足足够的细细胞数，在临床实实际工作作中，可以收集集到大量量自然脱脱落的细细胞标本本，这些细胞胞标本经经简单处处理后，即可得到到较好的的单分散散细胞，例如胸腹腹水，内镜刷检检细胞，膀脱冲洗洗液等四、脱落落细胞样样品的采采集这些材料料得到的的流式结结果，要谨慎的的分析解解释结果果的生物物学意义义。因这些材材料获得得的结果常出出现假阴性或假假阳性。原因是是其中的白细胞常有有变性，且样品细细胞数量量少。制备出一一个合格格的单细细胞样品品，其细胞数数要求在在1106/ml，其杂质碎碎片团块块应小于于2%以下，否则应放放弃检测测

13、，对肿瘤细细胞DNA异倍体的的分析样样品中，至少应有有20%的肿瘤细细胞存在在，(因占主峰峰1/5以上的异异倍体峰峰才可确确认为异异倍体)五、细胞胞悬液荧荧光染色色的质量量控制单细胞悬悬液样品品荧光染染色对流流式定量量分析的的精度很很重要。目前常使使用的荧荧光染料料有EB、PI、DAPI、AO、FITC、PE等，对细胞染染色时应应特别注注意染料料的特性性及量效效关系，定量细胞胞学荧光光染色易易受到多多种因素素的影响响，以致造成成不正确确的测定定结果，了解荧光光染色的的影响因因素，将有助于于在荧光光定量细细胞学分分析中，尽可能避避免测量量误差，并进行有有效的校校正措施施，如下的一一些常见见影响因

14、因素需特特别注意意。 温度对荧荧光染色色强度的的影响：在一般情情况下，环境温度度的升高高对荧光光染色有有明显的的影响。温度升高高可造成成溶液粘粘滞性增增加，溶剂和荧荧光染料料分子的的动力增增大，这就使荧荧光分子子和其他他分子之之间的相相互碰撞撞几率增增加，使荧光猝猝灭的可可能性增增加。因此，影响了荧荧光分子子发光量量子产额额温度对荧荧光染色色强度的的影响：温度升高高时，荧光减弱弱，荧光减弱弱的百分分比称温温度系数数。就一般荧荧光物质质而言，温度系数数大约为为1%，如果温度度在20时，一般荧光染染料即出出现温度度猝灭效效应，随温度的的升高，荧光猝灭灭作用越越强，以致造成成完全猝猝灭，温度在20以

15、下，荧光分子子发光量量子产额额的变化化不明显显，基本上保保持恒量量。因此在荧荧光测定定时要保保持染色色后的样样品在适适当低温温环境下下运行，尽可能减减少样品品的照射射时间，有条件时时应使样样品观察察室做到到恒温装装置，会得到更更好的荧荧光定量量结果2.荧光染色色液的浓浓度与荧荧光发射射强度有有直接比比例关系： 在溶液较较稀时，荧光强度度与浓度度成正比关系，随浓度加大，荧光强度度也增大大，当荧光染染料达到到一定浓度时时，如继续增增加浓度度不仅不不会使荧荧光强度度有相应应的增加加，反而使荧荧光强度度减低，这种因染染料浓度度增大使使荧光量量子的产产额下降降的现象象称为浓浓度猝灭灭现象2.荧光染色色液

16、的浓浓度与荧荧光发射射强度有有直接比比例关系： 因此在研研究浓度度与荧光光强度关关系时，必须检查查所得的的荧光值值是曲线线高峰前前的浓度度，还是曲线线高峰后后的浓度度(方法是减减少溶液液浓度，如荧光减减弱则为为高峰前前浓度)。鉴于荧光光染料浓浓度对荧荧光强度度的影响响之大，因此要选选择最合合适的浓浓度，对于荧光光定量检检测技术术是极其其重要的的 3.pH值对荧光光发射强强度的影影响： 荧光分子子在溶剂剂中处于于离子化化状态，因此，溶液中的的氢离子子浓度对对荧光强强度影响响极大，荧光分子子发光的最有利利条件是是其在溶溶剂中呈呈离子化化或极化化状态，从而通过过染料分分子本身身所具有有的斥力力作用尽

17、尽可能避避免分子子之间的的相互碰碰撞作用用，每一种荧荧光分子子都有自自己合适适的pH值4.其他一些些影响荧荧光强度度的因素素： 像醛类固定剂剂(戊二醛，甲醛),可以干扰扰荧光染染料与核核酸分子子的结合合,像溶剂中中的一些些不发光光的物质质(如溴化物、碘化物、氨基苯、硝基苯、铁、银离子等)均可造成成荧光的的猝灭现现象六、流式细细胞分析析资料处处理的质质量控制制 样品中的的碎片杂杂质和团团块过多多，所测细胞胞数仅占占20%以下，组方图的的基线抬抬高，尤其不能能进行细细胞周期期分析，尽管目前前有计算算机的硬硬件删除除或软件件补偿来来消除碎碎片和团团块的影影响，也应放弃弃不作分分析处理理六、流式细细胞

18、分析析资料处处理的质质量控制制一个样品品细胞数数检测应应在1万个细胞胞(不包括碎碎片、杂质、团块)。如果单独独作DNA倍体分析析而不作作细胞周周期的处处理，小于1万个细胞胞也可以以，但异倍体体细胞占占总细胞胞数的10%以下时，不可盲目目下结论论，至少异倍倍体细胞胞占总细细胞的20%以上，可以确定定异倍体体的存在在正常二倍倍体细胞胞组方图图的CV值大于8%以上，应放弃细胞胞周期的的分析，但肿瘤细细胞CV值大于8%，这与肿瘤瘤细胞DNA异质性增增大有关关。 对于一个个正常人人体的二二倍体细细胞群，G0/1期细胞占占85-90%左右，S+G2M细胞占10-15%，但在同一一个体的的不同正正常组织织，

19、细胞DNA含量也有有漂移，在不同个个体的同同源组织织也会出出现10%的漂移S期细胞可作为评价价肿瘤的的增殖活活性指标。大量报道道认为，S期有明显显的临床床预后意意义，但S期计算方方面容易产生生误差,而造成评评价S期在肿瘤瘤生物学学行为不不确切性性对于S期细胞计计算较准准确的方方法，就是分别别作两次次样品的的检测，加入DNA倍体标准准样品检检测一次次，不加二倍倍体标准准的样品品检测一一次，G0/1峰应是一一个正态态分布(或称高斯斯分布)。但实际测测量过程程,有部分组组方图有有时会出出现G0/1峰的右偏偏峰或脱脱尾(Teiling)现象，或出现一一个右或或左侧的的峭峰(Kurtosis)，造成S期

20、细胞计计算的不不准确性性。对于这样样峰位，除了可用用计算机机软件加加以消除除外，可放弃S期的计算算DNA倍体标准准的质量量控制：DNA倍体的标标准是根根据正常常二倍体体细胞DNA含量的分分布范围围而确定定的，对于二倍倍体的标标准的选选择，应遵照如如下原则则：采用同个个体同源源正常组组织。同种固定定方法。相同的样样品处理理方法。同样的染染色方法法,同步染色色。同样的的仪器检检测条件件。正常二倍倍体细胞胞作为内内标准。在不具备备同个体体，同源组织织的情况况下，可以使用用鸡红细细胞，或其他生生物细胞胞为内参参标准，作为计算算倍体的的标准细细胞，但这种标标准细胞胞的使用用，仅限于新新鲜组织织倍体的的判定，对于石蜡蜡包埋组组织倍体体标准，解决的办办法是将将正常组组织与肿肿瘤组织织同时包包埋于一一个石蜡蜡组织块块中，这样正常常组织作作为一个个二倍体体内标准准,能减少DNA倍体分析析的误差差。 假性异倍倍体的识识别与排排除：假性异倍倍体多出出现在近近二倍体体肿瘤(Near diploid)或DNA指数小于于1.30以下的异异倍体肿肿瘤。 假性异倍体出现的的原因主主要有组组织自溶溶造成或或在组织织固定前前或期间间，细胞DNA出现变性性(而非降解解阶段)，染色质结结构发生生变性，与荧光染染料结合合增加或或减少，更多出现现在异倍倍