第10章基因诊断Genediagnosis课件

1、 第十四章 基 因 诊 断 和 基 因 治 疗Gene diagnosis and Gene Therapy第一节 基因诊断第二节 基因治疗 1 第十四章 基 因 诊 断 和 基 因 治 疗Gene 第一节 基因诊断 重组DNA技术极大地丰富了我们对人类遗传病分子病理学的知识，同时也提供了从DNA水平对遗传病进行基因诊断的手段。 基因诊断：就是利用DNA重组技术从DNA 水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。2 第一节 基因诊断2一、直接诊断 直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近的DNA序列作为探针，或通过PCR 扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。

2、它主要适用于已知基因异常疾病 的诊断。3一、直接诊断31、Gene 缺失遗传病的诊断1）地贫的Gene诊断基因不同程度的缺失引起不同类型的地贫，基因缺失14个。正常Gene组用BamHI切割，可得到14kb的片段，而缺失一个 Gene时可得到10kb片段。BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe41、Gene 缺失遗传病的诊断BamHIBamHI21以Gene为探针，Southern blot 方法检测/ /- /- - - /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺414kb10kb5以Gene为探针，Southern blot 方法检测2）DMD/BMD的缺

3、失诊断（进行性肌营养不良或假肥大型）DMD是一种严重致死性疾病（XR），临床症状表现肌肉进行性萎缩和乏力。BMD临床症状与DMD相似，但症状较轻。Gene 定位Xp21 ， Gene 2300kb,79 个Exon ，cDNA全长13974bp 编码3685 Aa，分子量427kD。DMD/BMD 70%左右为缺失型，基因很大，缺失可能发生在不同的部位。应用多重PCR扩增检测，判断缺失状态。62）DMD/BMD的缺失诊断（进行性肌营养不良或假肥大型）6多重PCR扩增后电泳检测结果病例外显子 1 2 3 4 5 6 7 8Pm34350136476052bp5351137多重PCR扩增后电泳检测

4、结果病例外显子 1 22、突变型遗传病的基因诊断例 如：镰形细胞贫血的Gene诊断已知突变基因编码珠蛋白链的 第6位密码子 GAGGTG 谷Aa缬Aa82、突变型遗传病的基因诊断例 如：81）RFLP诊断已知限制酶MstII 识别序列 MstII 1.15kb CCTG AGG 1.35kb x probe CCTGTGG突变后不能识别，酶切位点消失，限制酶切片段长度发生变化。91）RFLP诊断已知限制酶MstII9限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检测，结果： 1.35kb1.15kb / /S S/S 正常 镰状 镰状贫血10限制酶切片段电泳后，经Southern Blot检

5、测，结果：2）ASO探针诊断 已知突变Gene部位和性质，合成寡和苷酸探针，32P标记，进行Southern Blot 杂交/斑点杂交。 Normal Gene Probe与正常 杂交 Mutation S Gene Probe与异常 S杂交 112）ASO探针诊断 已知突变Gene部位和性质，合成斑点杂交结果： / /S S/S 正常探针 突变探针12斑点杂交结果： / /S 二、间接诊断 主要通过Gene和DNA多态的连锁分析作出诊断。当致病基因虽然已知，但其异常尚属未知时，或疾病Gene本身尚属未知时，可通过对受检者及其家系进行连锁分析，推断受检者是否获得了带有致病基因的染色体或DNA

6、片段。 连锁分析是基于遗传标记与Gene连锁，子代是否获得遗传标记间接地判断做出诊断。 这些遗传标记是基因组中的DAN 多态，如：RFLP，VNTR 等。13二、间接诊断 主要通过Gene和DNA多态1、Gene异常不明确的遗传病的诊断例：成年型多囊肾病APKD，AD ，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD Gene与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列（3HVR）紧密连锁，因此，可以通过RFLP连锁分析进行诊断。141、Gene

7、异常不明确的遗传病的诊断例：成年型多囊肾病A 以3HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的Gene组DNA杂交Southern Blot杂交 Gene组DNA probe （3HVR）PvuII酶切 DNA片段 杂交 结果 15 以3HVR为probe与PvuII酶切后的家系有关成员的结 果 1 2 1 2 3 4 5 57kb 34kb 23kb 16结 果 1 结果分析患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段,说明致病基因与3.4kb片段连锁,并按孟德尔方式遗传.II5不含3.4kb片段,产前诊断正常.17结果分析17PCRRFLP诊断 甲型血友病的基因诊断，已知甲型血友病

8、XR，获得家系成员基因组DNA 。 PCR 142 bp BcLI 142bp 99 bp 43bp 电泳 结果分析？p1p2142bp99bp43bpBcl IBcl I -Bcl I +18PCRRFLP诊断p1p2142bp99bp43bpBcl问:1/ 2、1诊断；2/ 1是男或是女发病？ 142bp99bp1 2123III 119问:1/ 2、1诊断；2/ 1是男或是女发病？142b结果分析1）先症者II2具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。2）II2有142bp/99bp杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。3）1为99bp片段 如果是 男性 为患者（99bp片段来自母亲）；女