大黄中蒽醌类成分的提取、分离和鉴定

1、大黄中游离蒽醌类成分的提取、分离与鉴定一、实验目的掌握蒽醌苷元的提取方法-双相酸水减法掌握梯度 PH 萃取法提取分离大黄中各种蒽醌苷元的原理及操作方法掌握羟基蒽醌类化合物的颜色反应及薄层色谱鉴别方法二、实验原理提取原理双向酸水解法，为一相与酸水不相互溶的有机溶剂，另一相为酸水，加热回流水解的方法。 由于大黄中的羟基蒽醌类化合物多以苷的形式存在，所以首先要将苷水解成苷元，本实验选 用硫酸和乙酸乙酯作为双向酸水解的溶剂，采用加热回流方法，提取大黄药材中的游离蒽醌 类化合物。根据苷元不溶于水，可溶于乙醚、乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂的性质，即在加热 回流提取过程中，稀硫酸可将蒽醌苷元水解成苷元，游离出来

2、的蒽醌苷元随即溶于乙酸乙酯 中，从而将蒽醌苷元提取出来。分离原理pH梯度萃取法 羟基蒽醌类化合物酸性强弱不同，用pH梯度法进行分离。具有羧基或多 个B位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸氢钠溶液；具有一个B位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸钠 溶液；只具有a位酚羟基的蒽醌，酸性弱，只溶于氢氧化钠溶液。以分离酸度不同的蒽醌苷 元。也可利用游离蒽醌的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离。（1） 大黄中游离蒽醌的酸性强弱顺序 大黄酸（-COOH） 大黄素（B酚-0H） 芦荟大 黄素（醇-oh）大黄素甲醚（-och）大黄酚（-CH）（2）大黄中游离蒽醌的极性大小顺序 大黄酸大黄素芦荟大黄素大黄素甲醚大 黄酚大黄酚和大

3、黄素甲醚酸性相近，但极性不同，可用硅胶柱色谱法进行分离。三、实验方法四、 1.总蒽醌苷元的提取、分离工艺流程大黄药材（粗粉）50g加20%HS0 100ml,乙酸乙酯250ml,水浴回流2h,稍冷过滤24乙酸乙酯提取液药渣乙酸乙酯提取液药渣1 去除下层酸水层，再用蒸馏水水洗2次（50ml/次）直至乙酸乙酯层pH值呈中性乙酸乙酯提取液5%NaHCO 溶液萃取三次（80ml，60ml, 40ml）碱水层乙酸乙酯层碱水层卄滴加浓盐酸，调节pH=2,卄滴加浓盐酸，调节pH=2,放置5%NaCO溶液萃取三次（40ml/次）沉淀物（黄色结晶或黄色絮状沉淀）碱水层乙酸乙酯层沉淀过滤，冰醋酸精制黄色结晶（大黄

4、酸）滴加浓盐酸，调节pH=2，放置沉淀物（橙色结晶或橙色絮状沉淀）沉淀过滤,丙酮精制|橙色结晶大黄素）碱水层沉淀过滤，0.25%NaOH溶液萃v取三次（40ml/次）滴加浓盐酸，调乙酸乙酯层5%NaOH溶液萃卄节pH=2，放置 严三次（40ml/沉淀物（黄色结晶或黄色絮状沉淀）碱水层乙酸乙酯层沉淀过滤，冰醋酸精制黄色结晶（大黄酸）滴加浓盐酸，调节pH=2，放置沉淀物（橙色结晶或橙色絮状沉淀）沉淀过滤,丙酮精制|橙色结晶大黄素）碱水层沉淀过滤，0.25%NaOH溶液萃v取三次（40ml/次）滴加浓盐酸，调乙酸乙酯层5%NaOH溶液萃卄节pH=2，放置 严三次（40ml/次） 沉淀物调pH=2,沉

5、淀过滤橙色絮状沉淀）黄色沉淀物乙酸乙酯层乙酸乙酯精制硅胶柱色谱黄色针晶洗脱剂为石油醚（60-90C）芦荟大黄素）卄-乙酸乙酯（15： 1）大黄酚和大黄素甲醚混合物2. 总蒽醌苷元的提取大黄粗粉50g，置500ml烧瓶中，加20%硫酸溶液100ml和乙酸乙酯250ml,水浴回流提 取2h,放置，冷后过滤，残渣弃去，乙酸乙酯提取液置分液漏斗中，分出酸水层，乙酸乙 酯提取液用蒸馏水洗2次（20ml/次），将乙酸乙酯放置在锥形瓶中，密封。游离蒽醌的分离和精制（1）将乙酸乙酯提取液置500ml分液漏斗中，用5%NaHC03溶液萃取三次（80ml，60ml， 40ml），合并碱液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节

6、pH=2,放置，待沉淀析出完全后，过滤， 并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性，60C干燥，得深褐色粉末，主为大黄素。沉淀干燥后， 样品加冰醋酸 10ml 加热溶解，趁热过滤，滤液放置析晶，过滤，用少量冰醋酸淋洗结晶， 得黄色针晶为大黄酸。（ 2）大黄素的分离和精制经NaHCO3溶液提取的乙酸乙酯液，继用5%NaHCO3萃取三次，每次用量40ml，合并酸碱， 在搅拌下滴加浓盐酸，调节pH=2，析出棕黄色沉淀，抽滤，水洗沉淀物至洗出液呈中性， 60C干燥，沉淀经干燥后，用15ml丙酮热熔，趁热过滤，滤液静置，析出橙色针晶，过滤 后，用少量丙酮淋洗结晶，得大黄素。（3）芦荟大黄素的分离和精制经Na2C

7、03提取过的乙酸乙酯液，再用0.25%NaOH溶液提取三次，每次用量40ml，合并后 的碱液同（1）法处理。萃取液经酸化后析出黄色沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，用10ml 乙酸乙酯精制，得黄色针晶的芦荟大黄素。（4）大黄素甲醚和大黄酚混合物的分离和精制萃取除去芦荟大黄素后余下的乙酸乙酯层，再用5%NaOH溶液萃取多次（每次100ml）， 至碱水液呈无色为止，合并碱水层，加盐酸至呈酸性（pH23），析出黄色沉淀，过滤，水 洗至中性，干燥，为大黄酚和大黄素甲醚的混合物。将此混合物溶于乙酸乙酯，用硅胶柱色 谱分离。（ 5）柱层析分离大黄酚和大黄素甲醚装柱 取一玻璃层析柱,垂直固定在铁架台上，在管的下

8、端垫入少量棉花，装入100200 目硅胶（约1/3 高，湿法装柱）。上样 将样品置于小蒸发皿中，用少量石油醚分散，另加用3倍量硅胶拌和均匀，并于 水浴上缓缓蒸去溶剂。然后将含有样品的硅胶装入色谱柱的上端，并盖一圆形滤纸。洗脱 将色谱柱活塞打开，洗脱剂为石油醚（沸程 60-90C） -乙酸乙酯（15:1）混合 液。收集 洗脱液 25ml 一份，分别收集，回收溶剂至小体积，放置，即可析出结晶，合并 相同晶形部分。先洗脱下的化合物为大黄酚，后洗脱下的化合物为大黄素甲醚。游离蒽醌类化合物的鉴定（1）化学鉴定碱液试验分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，加lml乙醇溶液，加10%氢氧化 钠溶液数滴，观察颜色

9、变化。羟基蒽醌应显橙色到蓝紫色。醋酸镁试验分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，各加乙醇lml使溶解，滴加0.5% 醋酸镁乙醇溶液，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙色到蓝紫色。（2）色谱鉴定 薄层色谱鉴定吸附剂：硅胶G-CMC-Na板样 品：上述分别获得的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酚的三氯甲 烷溶液及各相应对照品的三氯甲烷溶液。展开剂：石油醚-乙酸乙酯-醋酸（2:1:0.2）展开方式：上行展开。显 色：在可见光下观察，记录黄色斑点出现的位置，然后用浓氨水熏成或喷5%醋酸镁 甲醇溶液，斑点显红色。实验结果记录：观察斑点颜色，记录图谱并计算Rf值。四数据记录、结果讨论与分析：实验现象加5

10、% NaHCO3溶液萃取后，收集下层溶液，一天后未发现结晶，使用旋转蒸发仪蒸发后，最 终得到黄色絮状大黄酸沉淀。加 5%NaCO 溶液萃取后，最终得到橙色大黄素结晶。加0.25% NaOH 溶液萃取后，精制最终得到黄色芦荟大黄素结晶。加 5% NaOH 溶液萃取后，得到黄色 的大黄酚和大黄素甲醚混合物，无法调节pH值分开，故使用柱层析分离。（1）碱液试验：取各类蒽醌的标准乙醇溶液，滴加10%Na0H后。大黄酸呈红色，大黄素呈 粉红色，芦荟大黄素呈红色，大黄酚呈红色。（2）醋酸镁试验：取各类蒽醌的标准乙醇溶液，滴加 0.5%的醋酸镁溶液后，大黄酸呈红色， 大黄素呈粉红色，芦荟大黄素呈橘黄色，大黄

11、酚呈橘黄色。（ 3）薄层板鉴定点样次序为： 1.2.3.4依次为柱层析洗脱液， 5 为大黄酚标准液， 6为大黄酸标准液， 7为大 黄酸自制， 8为大黄素标准液， 9为大黄素自制， 10 为芦荟大黄素标准液， 11 为芦荟大黄素 自制， 12为大黄素甲醚标准液。测得 Rf 值：大黄酸：标准液的Rf值为2.75/6.6=0.42,我组制得产物的数据缺失，图上无明显斑点大黄素：标准液的 Rf 值为 4.21/6.6=0.64,我组制得产物的 Rf 值为 5.8/6.6=0.88 芦荟大黄素：标准液的 Rf 值为 3.95/6.6=0.60,我组制得产物的 Rf 值为 4.81/6.6=0.73 大黄

12、酚标准液的 Rf 值为 5.65/6.6=0.86,大黄素甲醚标准液的 Rf 值为 5.7/6.6=0.86 柱层析洗脱液 1.2.3.4 的 Rf 值依次为 6.05/6.6=0.92; 5.9/6.6=0.89; 5.8/6.6=0.88; 5.71/6.6=0.87结果讨论加5% NaHC03溶液萃取后，收集下层溶液，一天后未发现结晶，可能与之前加的NaCl溶液过多，使收集的液体体积过大，大黄酸浓度过低引起，使用旋转蒸发仪蒸发后，最终得到黄 色絮状大黄酸沉淀。蒽醌类与醋酸镁显色反应的必要条件是蒽醌化合物中有a-酚羟基或邻二酚羟基结构。3.分析（1）游离蒽醌的提取要控制温度，回流不宜太剧烈。要注意碱液浓度及萃取时的静置时间 对实验结果的影响。2）0H22）0H2A大黄酸R1=HR2=COOHB 大黄素R1=CH3R2=OHC 芦荟大黄素