常量法和微量法测定蛋白质含量综合性实验设计

1、常量法和微量法测定蛋白质含量综合性实验设计摘 要：蛋白质含量测定是生物化学和分子生物学研究中最常用的分析方法之一。该文以Bradford法为基础，利 用紫外分光光度计（常量法）和多功能酶标仪（微量法）分别进行蛋白质含量测定。在此基础上，总结了常量法 和微量法在测定蛋白质含量中的异同点。结果表明：常量法适合样品数量少、体积大的体系；而微量法则可以大 大提高测试效率，特别适宜样品数量多、体积少的体系表征。由于微量法在相同条件下可同时完成多个样品的测 试，具有更高的测量准确性。两种方法在实验中的综合运用可大大提高实验效率，有助于学生掌握Bradford法测 定蛋白质含量的原理，认识常量法和微量法测定

2、蛋白质含量的共性及特性，提高学生对紫外分光光度计和多功 能酶标仪工作原理及工作特点的认识，显著提升学生的实验能力和逻辑思维能力，为从事相关科研工作奠定 基础。关键词：蛋白含量测定；常量法；微量法；Bradford法Design of comprehensive experiment on determining protein content by using both macro-method and micro-methodAbstract: Protein content determination is one of the most commonly used analytical

3、methods in biochemistry and molecular biology. Based on the Bradford method, protein content is determined by using both the ultraviolet spectrophotometer (macro-method) and multimode enzyme marker (micro-method). On this basis, the similarities and differences between the constant method and the mi

4、cro-method in the determination of protein content are summarized. The results show that the constant method is suitable for the system with small number of samples and large volume, and the micro-rule can greatly improve the test efficiency, especially suitable for the system characterization with

5、large number of samples and small volume. Because the micro-method can complete the test of multiple samples at the same time under the same conditions, it has higher measurement accuracy. The comprehensive application of the two methods in this experiment can greatly improve the experimental effici

6、ency, help students master the principle of Bradford method to determine protein content, understand the common characteristics and characteristics of constant method and micro-method, improve the students understanding of the working principle and characteristics of UV spectrophotometer and multifu

7、nctional enzyme marker, significantly enhance their experimental ability and logical thinking ability, and lay a foundation for related scientific research work.Key words: protein content determination; macro-method; micro-method; Bradford method实验教学在化学和生物学科教学中承担着不可替代的作用，是学生从事科研工作的基础。综合性设计实验有利于将传统的实

8、验教学“以教师为中心”的 模式转变为“以学生为中心”的模式。综合实验的开 展有助于提高学生查阅文献和归纳总结的能力，是提 高学生创新能力的重要途径之一1-2。蛋白质是组成人 体细胞的基本成分，机体的重要生命活动都需要蛋白质的参与，它是生命活动的主要承担者A4】。蛋白质测 定是指通过物理或化学方法对蛋白质含量进行测定， 是生物化学和分子生物学研究中最常用的基本分析方 法之一。测定蛋白质含量的方法包括凯氏定氮法、双 缩脲法、酚试剂法、紫外吸收法和考马斯亮蓝法（Bradford法）等。其中，Bradford法因具有灵敏度 高、测定快速简便和干扰物少等优点备受关注Ji】。 基于Bradford法测定蛋

9、白质含量的实验是生物化学本 科教学实验的重要组成部分，但实验一般基于一种方 法进行，往往导致两方面问题：一方面，学生不能很 好地掌握常量法和微量法的区别；另一方面，单一仪 器的应用很难解决多分组实验拥挤等资源紧张的问 题。基于此，本文设计了利用紫外分光光度计（常量 法）和多功能酶标仪（微量法）同时进行蛋白质含量 测定的综合性实验。这种方法是根据蛋白质与染料相 结合时产生复合物导致染料的颜色发生变化的原理设 计的，如图1所示。图1 Bradford法测定蛋白质含量的原理示意图染料考马斯亮兰G-250（二甲花青亮蓝）的磷酸 溶液呈棕红色，最大吸收峰在465 nm，在酸性条件下 其可与蛋白质中的精氨

10、酸和芳香氨基酸结合，形成复 合物时，溶液呈现浅蓝色，导致染料的最大吸收峰的 位置变为595 nm。在一定范围内，595 nm处测定的 吸光度值A595与蛋白质含量呈线性关系，因此可以用 于蛋白质含量的测定511o紫外分光光度计12 和多功能酶标仪13-15 都是测 量吸光度的仪器，但原理存在一定差异。紫外分光光 度计在测量过程中可以通过设置特定波长的单色光直 接作用于样品（见图2（a），进而测得其在特定波长的 吸光度；而多功能酶标仪则首先通过一定波段的滤光 片获得目标波段,经过光路改变器改变入射光的方向， 从顶部垂直照射在样品上（见图2（b），进而测得样品 的吸光度。另外，两种测量方法使用的样

11、品池不同， 紫外分光光度计测定吸光度一般用常量石英比色皿样 品池，而多功能酶标仪则使用微量孔板（如96孔板或 384孔板），使用移液枪将样品转移到孔板中。由于测 量样品的体积不同，上述两种方法分别被称为常量法 和微量法。相比于紫外分光光度计，多功能酶标仪根 据用途的特殊性限定了范围和设置界面,快速且简便。 同时，多功能酶标仪可同时在短时间内检测几十组样 品，工作效率大大提高，这可保证不同样品在相同静 置时间和仪器状态下进行测定。（b）多功能酶标仪的工作原理图2紫外分光光度计和多功能酶标仪的工作原理本实验首先配制了不同浓度的蛋白溶液并进行了 吸光度测定，在此基础上绘制标准曲线方程，随后对 未知样

12、品进行测定，将其吸光度值代入标准曲线方程 即可求得未知样品中的蛋白含量。在此基础上，考察 了 SDS对蛋白质含量测定的影响并分析了原因。实验 中，将学生分为两组，在测量蛋白质含量和SDS干扰 时仅选择一种仪器进行试验即可。这样，每组学生均 可使用两种仪器进行吸光度测定，有助于拓宽学生的 知识面。本实验同时利用紫外分光光度计和多功能酶标仪 开展实验，一方面，有助于学生同时掌握常量法和微 量法测定蛋白质含量，了解上述两种仪器工作原理、 操作流程和使用方法，为今后从事科研工作奠定基础o 另一方面，由于多功能酶标仪和紫外分光光度计的配 合使用，将大大提高多分组实验的测量效率，同时有 助于学生学习和使用

13、移液枪等常用工具，非常适合作 为综合性实验向本科生开设。1实验部分1.1实验目的（1 ）掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量 的原理与方法。（2 ）熟练紫外分光光度计和多功能酶标仪的使用 和操作方法。（3）了解紫外分光光度计和酶标仪测量方法的异 同点。1.2实验药品与实验仪器实验药品：牛血清蛋白BSA（纯度98%，Sigma）； 考马斯亮蓝G-250（ 99.9%，Sigma）；乙醇（99%，上 海国药）；85%的磷酸溶液（上海国药）；SDS（ 98%， Sigma ）。实验仪器：紫外光分光光度计/多功能酶标仪；漩 涡混合器；容量瓶；量筒；电子分析天平；EP管/96 孔板；试管架；移液枪；一

14、次性枪头。1.3溶液配制（1）配制1 mg/mL BSA标准蛋白质溶液：称量 BSA 100 mg，用超纯水溶解并稀释至100 mL。（2）配制0.01% （w/w）的考马斯亮兰G-250染 料溶液：称量100 mg的考马斯亮兰，先溶于50 mL 95%的乙醇，再加入85%的磷酸溶液120 mL，用超纯 水稀释至1 000 mL。（3）不同浓度的样品液：取1 mg/mL的BSA母 液，用超纯水稀释到所需浓度。（4）配制SDS 100 pg/mL的SDS溶液：称量SDS 粉末10 mg，加入超纯水溶解并稀释至100 mL。表1考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度-标准曲线的 绘制所需样品的组分样品管号12

15、34567未知1未知2标准蛋白00.10.20.40.60.81.01.01.0(100 pg/mL)/mL超纯水/mL1.00.90.80.60.40.2000考马斯亮兰溶液3.03.03.03.03.03.03.03.03.0(0.01%)/mL蛋白质浓度/02.55.010 .015.0 20.025 .0(pg-mL 1)1.4实验方法1）常量法和微量法测定蛋白质含量。（1 ）取9支试管，按表1分别编号后依次加入标 准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料溶 液，加完后立即在漩涡混合器上混合。（2）上述混合后的样品室温下静置3 min，两组 同学分别使用紫外分光光度计和多功能酶标

16、仪测定样 品在595 nm处的吸光度A595 （使用紫外分光光度计时, 选择石英比色皿为样品池，以第一管为空白，加入一一 定体积的溶液；使用酶标仪时，取96孔板，依次按照 编号用移液枪移取样品200 rL至对应孔中，每个样品 平行测定5组求平均值）。（3）分别以蛋白浓度和A595为横坐标和纵坐标作 图并进行直线拟合，得到标准曲线方程（片*b）。（4）测量未知蛋白样品的吸光度A595,将测量值 代入标准曲线方程，即可求得未知样品中的蛋白含量。2）SDS干扰试验。（1 ）取7支试管，分别编号后按表2剂量依次加 入标准蛋白、SDS、超纯水和考马斯亮兰染料溶液。 每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合

17、。（2）将上述溶液混合后静置3 min，使用紫外分 光光度计或多功能酶标仪（本文仅使用紫外分光光度 计进行测量），测量595 nm处吸光度A595。分别以A595 和SDS浓度为纵、横坐标作图，绘制SDS干扰试验 的曲线，在此基础上分析其干扰机理。表2测定SDS干扰实验曲线的样品编号及 不同成分的含量样品管号2-1 （空白）2-22-32-42-52-62-7标准蛋白/mL00.10.10.10.10.10.1(1 mg/mL)超纯水/mL1.00.90.80.70.50.30.1考马斯亮蓝染液3.03.03.03.03.03.03.0(0.01%)/mLSDS溶液000.10.20.40.6

18、0.8(100 pg/mL)/mL2结果与讨论2.1常量法测定蛋白质含量首先利用常量法测定了蛋白质含量，通过紫外分 光光度计测量了表1中不同浓度的BSA溶液与染料作 用后在595 nm处的吸光度值，作为纵坐标，BSA浓 度为横坐标进行作图，绘制标准曲线并进行拟合，如 图3所示。通过拟合曲线得到相关系数R2为0.996 72， 相关性好，可用于进一步标定和计算未知蛋白质的浓 度。此时，本文进一步对未知蛋白1和2进行测定， 其在595 nm处的吸光度值分别为0.543和0.760,代图3通过常量法（紫外分光光度计）测量的标准曲线入标准曲线方程得出未知蛋白浓度为12.62 pg/mL和 18.63

19、pg/mLo2.2微量法测定蛋白质含量随后利用微量法测定了蛋白质的含量，通过酶标 仪同时测量了表1不同浓度的BSA溶液与染料作用后 在595 nm处的吸光度值(每组样品平行测定5个孔求 平均值)，以其为纵坐标，BSA浓度为横坐标进行作 图，绘制了标准曲线并进行拟合，如图4所示。通过 拟合曲线得到相关系数舟为0.998 08,相关性好，可 用于进一步标定和计算未知蛋白质的浓度。此时，进 一步对未知蛋白1和2进行了吸光度测定，其在 595 nm处的吸光度值分别为0.323和0.430,代入标 准曲线方程得出未知蛋白浓度为14.70 pg/mL和 20.15 pg/mL，与通过常量法测得的数据相比，

20、更接近 未知蛋白的实际浓度15 pg/mL和20 pg/mL，这主要 是由于多功能酶标仪在测量过程中使用孔板，每次可 同时测定多个样品，每个样品可平行测定多组，保证 了同样的仪器状态和样品放置时间，一定程度上提高 了测量的准确度，且大大提升了测量效率。但由于孔 板的利用，也会导致实验成本相对增加。上述结果表明，尽管常量法和微量法均可用于蛋 白质含量测定，但两种方法的测量原理、所需样品量、 测量效率以及测量准确度均存在差异，研究中需要根 据实际情况进行选择。当需要测量的样品数量多，体 积小时，应该选择多功能酶标仪利用微量法进行测定； 而当样品数量较少，样品体积较多时，可选择紫外分 光光度计用常量

21、法进行测定。如果样品数量和体积居 中，可以依据实验对测量准确度和实验成本等因素的 要求选择其中一种方法进行测试或选取两种方法平行 验证。图4通过微量法(酶标仪)测量的标准曲线2.3 SDS对蛋白质含量测定的干扰尽管Bradford法具有很多优点，但也存在一定缺 点，如一些物质存在会干扰测量的准确性，这些物质 主要包括去污剂、Triton X-100和SDS等，本部分考 察了 SDS对蛋白质含量测定的干扰。利用常量法对表2 的样品进行了测定，分别以吸光度和SDS浓度为纵、 横坐标进行作图，结果如图5所示。图5 SDS对蛋白质含量测定的干扰曲线从上图可以看出，SDS可显著干扰蛋白质含量测 定，测量结果表明：吸光度随SDS浓度的增加出现了 先减小后增大的现象，造成上述结果的主要原因是， SDS可以有效断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白 质的二级结构和三级结构