干扰技术基本原理与应用

1、关于干扰技术基本原理与应用第1页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三什么是RNA干扰RNA干扰(RNA interference，RNAi),又称转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指将特异性同源双链RNA(dsRNA)导入到细胞内，使目的基因的不表达或表达水平下降.2001、2002年连续被Science评为年度十大成就!第2页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三目前应用的基因干扰技术DNA水平的基因干扰技术基因敲除技术寡核苷酸与双链DNA 杂交采用多胺等小分子识别并阻遏特定转录因子第3

2、页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三目前应用的基因干扰技术mRNA水平的基因干扰技术用反义RNA 技术阻遏翻译过程, 破坏内源性mRNA设计寡核苷酸来破坏与mRNA 结合的蛋白质, 使mRNA 不稳定双链RNA 干扰技术（RNAi）第4页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi的发现和发展历程1984 年,Jonathan 研究小鼠L 细胞时发现反义mRNA 会干扰同源基因的表达，机制不清1990年 Jorgensen等 矮牵牛颜色加深实验 “共抑制(co-suppresion)”第5页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNA

3、i的发现和发展历程1995年 Su Guo 和Ken Emphues 反义RNA阻断秀丽小杆线虫par-1基因的表达 实验 首次发现 RNA干扰现象1998年 Andrew Fire和Craig Mello 发现单链RNA抑制作用较弱，而纯化的dsRNA可高效、特异地抑制基因的表达 Nature1998； 391: 806-11 正式提出RNA干扰的概念第6页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi的发现和发展历程1999年 Tuschl等 报道在哺乳动物中也存在RNAi2001 年 Berstein 等 提出只有22 核苷酸dsRNA才有特异性的阻断效应，并发现体内分

4、解dsRNA 为siRNAs (short/small interfering RNA) 的DICER 酶第7页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi的发现和发展历程2002 年 Novina 等 用RNAi 技术实现了对HIV-1 病毒的阻抑2004年 Morris 等 用RNAi技术实现了对人细胞基因的抑制 Science 2004(August 27)；305：1289-1292第8页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi的主要特点和优势诱导转录后水平的基因沉默具有高度的特异性抑制基因表达的高效性可在不同细胞之间传递甚至传到子代中去 “

5、基因沉默系统化”第9页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶共同点 特异性 靶向性第10页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三siRNA 与反义寡核苷酸、核酶、脱氧核酶不同点独特的双链结构需要Dicer、RdRp 、解旋酶、激酶等协同因子siRNA 本身无催化活性在细胞内可能具有相对的稳定性具有一定的可遗传性第11页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi的主要过程启动阶段 dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特异性识别，以一种ATP依赖的方式逐步切割成siRNA长度：21-2

6、5nt结构：3端悬垂两个未配对的碱基UU第12页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三细胞中内源性dsRNA的形成基因组中DNA 反向重复序列的转录产物同时转录反义和正义RNA 病毒RNA 复制中间体以单链RNA 为模板由细胞或病毒的RNA 依赖RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA第13页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三Dicer酶RNAase III超家族成员。结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶结构域，一个双链RNA结合位点对单链RNA没有活性对200500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA广泛存在第14页

7、，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RdRp（RNA dependent RNA polymerase）使异常的RNA转变为dsRNA参与细胞内dsRNA和siRNA的扩增siRNA与靶mRNA 的结合可激活RdRp，形成大量的dsRNA第15页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi的主要过程效应阶段RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC） 的形成RISC的激活：ATP依赖的解双链过程在siRNA反义链的指导下(靶序列的识别），RISC特异性切 割、降解靶mRNA，导致基因表达失活 第16页，共4

8、8页，2022年，5月20日，13点34分，星期三第17页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi技术的实验方法siRNA的设计原则序列大小 19-21nt ，最好以A或G开始从mRNA的AUG开始，寻找AA二连序列，作为潜在的RNAi靶位点不要针对5和3端非编码区（untranslated regions，UTRs) 第18页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi技术的实验方法siRNA的设计原则设计24个序列, BLAST 比对基因序列以确保序列设计的特异性优先选择 GC 含量30-50%的序列设计适当的阴性对照序列第19页，共48页，20

9、22年，5月20日，13点34分，星期三阴性对照序列的设计特异性siRNA中的碱基进行随机排列，且行BLAST基因比对 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG在特异性siRNA引入12个错配碱基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG第20页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三目标序列筛选的相关网站/Stu/shilin/rnai.html/sirna.pl/rnai/http:/RNAiD/rnaidesigner/:9331/RNAi/html/rnai.html 第21页，共48页

10、，2022年，5月20日，13点34分，星期三查找已经证实的siRNA的网站/catalog/category.aspx?key=49/techlib/tb/tb_502.html/mmcmanus/www/siRNADB.html/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published 第22页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三siRNA的制备方法体外制备方法化学合成siRNA体外转录获取siRNA利用Dicer或 RNase消化长的dsRNA成siRNA第23页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三化

11、学合成法制备siRNA优点： 纯度高 合成量不受限 能被标记缺点：价格昂贵、合成周期长用途：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究 第24页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三体外转录法制备siRNA优点：简单 成本低 速度快 毒性小 稳定性好 缺点：反应规模和量始终有一定的限制用途：筛选siRNAs，特别是需要制备多种 siRNAs 第25页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三siRNA的制备方法细胞内制备方法依赖表达质粒或病毒载体在细胞内获取siRNA通过PCR介导的siRNA表达试剂盒获取siRNA第26页，共48页，202

12、2年，5月20日，13点34分，星期三siRNA载体依赖RNA聚合酶III 启动子(pol III) ，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。人源U6启动子 鼠源的U6启动子 人H1启动子pol III可在细胞中表达许多的小分子RNA，通过添加一串（36个）U来终止转录的需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链再克隆到载体中 第27页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三表达载体法制备siRNA优点：可以进行较长期研究。载体可以在细胞中持续抑制靶基因达数星期或更久缺点：需要进行克隆，周期长，质粒载体表达效率较低用途：唯一可以用于长期基因沉寂研究的方法第28页，

13、共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三基于PCR的siRNA表达框架(SECs) 组成：RNA pol III启动子 发夹结构siRNA RNA pol III终止位点制备：PCR ，无需克隆和测序第29页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三用SECs制备siRNA优点：可直接由PCR得到，方法简便，时间短在PCR片段两端添加酶切位点，筛选出 最有效的siRNA可用于构建表达载体可以用来筛选特定研究体系中启动子和siRNA的最适搭配 第30页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三用表达框架制备siRNA缺点：PCR产物很难转染到细胞中不能进

14、行序列测定，PCR和DNA合成时可能产生的误读不能被发现导致结果不理想 用途：筛选siRNA序列在将siRNA克隆到载体前筛选最佳启动子 第31页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三第32页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三第33页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三第34页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三shRNA(short hairpin RNA) 文库 Nature 2004 ；428： 427 - 431 (25 March) 针对：9,610 human genes 5,563 mouse gen

15、es 构建成：28,000个shRNA表达盒(cassettes)商品化试剂盒：Expression Arrest(美国冷泉港实验室 Open Biosystems公司) 网上数据库中选择特定的shRNA克隆，无需再耗时耗力进行siRNA的设计、合成和验证过程第35页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三CAM:氯霉素抗性基因 hr：同源重组位点Barcode：每个shRNA独特的识别序列 MSCV：病毒载体骨架 PKG-Puro：哺乳动物细胞中载体稳定性的选择Kan、oriT、RK6：逆转录病毒信号序列第36页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三siRN

16、AshRNA使用代价高相对较低持久性最多2周可选择获得稳定整合的细胞宿主类型细胞系原代细胞，胚胎干细胞、细胞系设计复杂的设计方法完成获取需要合成完成应用瞬时转染瞬时转染、稳定转染、病毒侵染检测方法Western杂交、表型分析RT-PCR、芯片检测Western杂交、表型分析、RT-PCR、芯片检测研究领域细胞培养细胞培养&体内研究第37页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三第38页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三第39页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三第40页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三siRNA转

17、染细胞 .磷酸钙共沉淀 电穿孔法 DEAE-葡聚糖和polybrene 机械法 ：显微注射和基因枪 阳离子脂质体试剂 第41页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三提高转染效率的方法纯化的siRNA避免使用抗生素避免RNA酶污染 较低传代数的细胞 合适的转染试剂 合适的阳性对照荧光标记的siRNA 第42页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi技术的应用基因组功能研究的新方法研究信号传导通路的新途径 开展基因治疗的新策略 （抗病毒、抗肿瘤等）筛选药物靶点的新工具第43页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi技术抗病毒作用阻止

18、病毒入侵、抑制病毒的复制和转录自然界中普遍存在在医学上的应用RNA病毒：如HIV、HCV、脊髓灰质炎病毒DNA病毒：如HBV第44页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi技术阻止HIV的入侵Novina将针对CD4的dsRNA导入 能表达CD4、CCR 5、CXCR4的M agi2CCR 5 细胞系），能使细胞表面CD4 表达减少75%；转染后60 小时后, 再用H IV 感染, 结果发现CD4-siRNA 转染的细胞很少有包涵体出现其它试验的受体： CCR 5、CXCR4第45页，共48页，2022年，5月20日，13点34分，星期三RNAi技术抑制HIV的复制将HIV-1编码rev的基因和同源的d