基因诊断与治疗课件

1、第7章 基因诊断与治疗（Gene Diagnosis and Therapy ）概 述分子生物学领域日新月异的进展为基础科研的成果应用于临床疾病检查和治疗奠定了坚实基础，使得以DNA分子重组、杂交和DNA转移技术为基础的分子医学（基因诊断和治疗）成为当今生物医学科学最为活跃的前沿领域之一。7.1 基因诊断概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构（DNA水平）及其表达水平（RNA水平）是否正常，从而对疾病做出诊断的方法。基因诊断的常用技术方法核酸分子杂交技术限制性内切酶图谱分析法DNA限制性片段长度多态性（RFLP）等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）杂交法PCR基因测序基

2、因芯片技术单链构象多态性PCR (SSCP-PCR)单链DNA碱基组成和(或)排列顺序不同,形成的构象就不同, 在非变性PAGE中电泳中会表现出不同的迁移率SSCP可以区分1bp的差异PCR-SSCP分析不能确定基因变异的内容，因此电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质灵敏度高。单拷贝基因虽然很少，难以检测，但目前已有使基因或其片段高度扩增的PCR 技术以及高灵敏度的基因探针可以应用，所以待测标本往往只需微量，目的基因只需pg水平就已足够。 基因诊断的特点（2）稳定性高。基因的化学组成是核酸,它比蛋白质稳定得多,长期保存的蜡块中常能顺利检出。而且被检测的基因不需要一定处于活性状态。

3、基因诊断的特点（3）临床应用前景好。随着分子生物学技术的普及,在配备有一定的仪器和试剂盒的情况下，在临床实验室开展基因诊断是完全可能的。 基因诊断的特点（5）基因诊断的策略基因突变的检测 基因突变检测法可检测基因大片段缺失和插入、小片段缺失和插入、点突变、异常基因重排和异常基因融合等的检测。 基因连锁分析 基因连锁分析是指采用紧邻致病基因区域的多态性标志或已知基因为坐标在一个家系中探查其致病基因的分析方法。 感染性外源疾病基因的检测 包括感染性病毒、细茵、寄生虫、支原体、衣原体等在人体内存在的外源性生物DNA或RNA 基因异常表达的检测 基因诊断的临床应用基因诊断 在感染性疾病诊断中的应用 病

4、毒 细菌 螺旋体 支原体 衣原体 寄生虫基因诊断 在遗传性疾病和产前诊断中的应用 血红蛋白病 杜氏肌营养不良症 苯丙酮尿症 脆性X综合症 镰状细胞贫血症53Mst酶切位点(GCTNAGG)53突变基因1.35kb正常基因1.15kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析突变使基因内部的一个Mst限制酶切位点丢失突变携带着0.2kb1.15kb1.35kb正常人患者基因诊断 在肿瘤学及肿瘤诊断中的应用 肿瘤染色体易位及融合基因的检测 癌基因与抗癌基因的检测 肿瘤相关病毒的检测 肿瘤细胞多药耐药基因的检测 微卫星不稳定性的检测 端粒酶活性的检测亲子鉴定个体识别法医物证基因诊断 在个体识别中的应用

5、某名人儿 子？ 器官移植(包括骨髓移植) 的主要难题是如何解决机体对移植物的排斥反应。理想的方法是进行术前组织配型。基因诊断技术能够分析和显示基因型,更好地完成组织配型,从而有利于提高器官移植的成功率。基因诊断 在器官移植组织配型中的应用7.2 基因治疗基因治疗（Gene Therapy）：将有功能的基因转移到病人的细胞中以纠正或置换致病基因的一种治疗方法，特指将有功能的目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内的基因发生整合，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产物起到对疾病的治疗作用。若目的基因不与宿主细胞基因组发生整合，但可通过暂时表达产物发挥治疗作用的方法叫基因疗法（gene thera

6、peutics），此法实际上就如同临床上使用的药物治疗一样，这与传统意义上的基因治疗是有区别的。 基因治疗的措施基因置换(gene reptacement)：致病基因整个地被有功能的正常基因所置换，使致病基因永久地得到更正。基因修正(gene correction)：致病基因的突变碱基序列得以纠正，正常序列部分予以保留。基因修饰(gene augmentation) ：目的基因导入缺陷细胞或其它细胞，其表达产物可修饰和改变缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。基因失活(gene inactivation)：应用反义技术(antisense technology)特异封闭某些基因的表达，以达到抑

7、制某些有害基因的表达的目的。 基因治疗主要过程病人基因诊断缺陷基因正常基因基因导入健康人基因载体基因治疗的基本流程（一）外源基因的选择与制备 （二）载体的选择与构建 （三）靶细胞的选择（四）基因转移 （五）基因转染细胞的筛选与鉴定（六）回输体内 （一）外源基因的选择与制备 在了解疾病发生的分子机制基础上， 选择对疾病有治疗作用的特定基因。 如对单基因缺陷遗传病，可用野生型（非突变）基因即可用于治疗； 对于肿瘤，最好选择某些与该类肿瘤密切相关的癌基因或抑癌基因用于基因治疗。 治疗性基因获得的方法很多： 用酶切或探针杂交法从基因组DNA文库获得，从cDNA文库获取，PCR扩增，人工合成等。 基因治

8、疗关键步骤之一，是将治疗基因高效转移入患者体内、并能调控其适度表达。 常用的载体有两类：病毒载体和非病毒载体。 病毒载体：逆转录病毒载体， 腺病毒载体， 腺相关病毒载体等； 非病毒载体：与病毒载体的主要区别在于采用理化方法将治疗基因转移入患者体内。（二）载体的选择与构建 (三) 靶细胞的选择 生殖细胞: 禁止体细胞： 淋巴细胞、造血细胞、 内皮细胞、肌肉细胞、 肝细胞、成纤维细胞 肿瘤细胞等 可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素来确定。选择的原则： (1) 便于从体内取出和回输； (2) 便于在体外培养与增殖； (3) 便于基因的高效转移； (3) 能够持续表达目的基因。Vector

9、 DNAHelper DNAEngineering a Virus into a Vectorwildtype virusViral vectorreplicationproteinsstructuralproteinsPackagingTherapeutic geneessential viral genesPackaging cellYvectorVector uncoatingTherapeutic mRNAand proteinEpisomal vectorIntegrated expression cassetteTarget cellGene Transfer 治疗基因导入受体细胞

10、的方法 化学方法物理方法膜融合法病毒载体法质粒DNA直接转移法 磷酸钙法 DEAE葡聚糖法 电穿孔法 粒子轰击法（基因枪法）（四）基因转移方法 标记基因技术 基因缺陷型受体细胞技术 基因共转染技术 分子杂交技术 外源基因表达鉴定( 五 ) 转导细胞的选择鉴定( 六 ) 回输体内将治疗性基因修饰的细胞以不同方式回输体内。基因治疗的应用遗传病： 替补法，导入正常基因病毒性疾病： 阻断病毒基因在体内的转录和翻译肿瘤： 基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因疗法 1990 美国医学家WF安德森等人对腺甘脱氨酶缺乏症（ADA缺乏症）的基因治疗，是世界上第一个基因治疗成功的范例。腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的

11、严重联合免疫缺陷(SCID)病因:淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)治疗策略：淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10% 维持免疫系统功能 改善病人症状Ashanti de Silva. Ashanti was the first patient to be treated with gene therapy. She received infusions of T cells that had been transduced with a gene for ADA中国的基因治疗1991.121995.6, B型血友病 逆转录病毒，因子IX，二兄弟凝血因子IX在体内持续表达16个月以上，血浆凝血因子IX水平增高1 3倍，临床症状有所改善。复旦大学与长海医院薛京伦 (复旦大学) 问