亲子鉴定汇总培训课件

1、思考题：1、亲子鉴定的原理是什么？2、法医学常用的遗传标记有哪些？3、计算父权排除概率和父权指数的法医学意义是什么？4、如何评价Y染色体和线粒体DNA遗传标记在亲子鉴定中的应用价值？第一节 概述第二节 亲子鉴定常用的遗传标记第三节 DNA遗传标记的检测技术第四节 亲权鉴定的结果分析第一节 概述 亲子鉴定（identification in disputed paternity）是指应用医学、生物学和人类学的方法检测遗传标记，并依据遗传学理论进行分析，从而对被检者之间是否存在生物学亲缘关系所作的科学判定。起源回顾历史记载 三国时期滴骨法文学戏剧等 秦剧三滴血描绘的合血法 电视剧 甄嬛传描绘的合血

2、法 上世纪初(1901年) Landsteiner ABO Southern技术 1980 Whyman and white RFLP技术 指纹 1985 Jeffery DNA fingerprint 基因扫描 1990 STR based PCR 亲子鉴定的应用常见于：1 涉及民事纠纷的亲子鉴定（1）涉及婚生或非婚生子女抚育责任或财产继承的诉讼案；（2）怀疑医院调错婴儿或试管婴儿配子错配的诉讼案。2 涉及刑事案件的亲子鉴定（1）强奸案或违法性犯罪案件对婴儿（或胎儿）亲生父亲的确定；（2）碎尸案中的身源认定；（3）杀婴、拐骗儿童等案件中孩子身源的认定。3 涉及行政事务的亲子鉴定（1）移民涉外

3、公证；（2）失散亲人亲缘关系的认定；（3）计划外生育责任人的确认及其子女户籍的注册。最常见：父权鉴定（paternity testing)亲子鉴定的依据 妊娠期限非遗传特征 性交及生育能力遗传特征（主要）亲子鉴定的依据遗传性状（或遗传特征）是生物体表现的一切形态特征、生理特征和代谢类型的统称。 单纯遗传特征人类的遗传性状 复杂遗传特征分析单基因遗传特征是亲子鉴定最可靠、最基本和最常用的方法。亲代基因型组合子代基因型aaaaaabbaaabbbbbbbabababaaabaa，abbbbb，abaa，bb，ab法医遗传标记（genetic marker）产物水平遗传标记血液细胞表面的遗传标记（红

4、细胞型、白细胞型、血小板型）血液蛋白质的遗传标记（红细胞酶型、血清酶型、血清型）DNA水平遗传标记DNA序列多态性DNA长度多态性亲子鉴定原理 亲子鉴定的基本原理有以下两点：在肯定孩子的某个等位基因必须来自生父，而假设父亲并不具有这个基因的情况下，可以排除其亲子关系。在肯定孩子的某个等位基因必须来自生父，而假设父亲具有这个基因的情况下，不能排除其亲子关系。The Monk and his peas An Austrian monk, Gregor Mendel自由组合律分离率染色体 父亲给一半 母亲给一半chromosomefromfatherchromosomefrommother基因组 D

5、NA 信息传递根据遗传标记排除父权 血型组合母亲 孩子生 父 基 因可 以 排 除 父 权不 能 排 除 父 权aaaaabbaa、abaaabbaabb、ababaaabbaa、abbbbbbaabb、abbbababbaa、ababbbbaabb、abababa、b-aa、bb、abAutosomal (passed on in part, from all ancestors)Y-Chromosome(passed on complete, but only by sons)Mitochondrial (passed on complete, but only by daughters)

6、Lineage MarkersFigure 9.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press非孟德尔遗传规律 mtDNA 母系遗传模式亲子鉴定的程序（一）案件受理（二）样品检验（三）鉴定意见第二节 亲子鉴定常用的遗传标记一、遗传标记的选择 亲子鉴定的DNA遗传标记必须具备以下条件：1、基因座定义和具有的特征已有文献报道；2、种属特异性、灵敏性、稳定性研究已实施；3、遗传方式符合相应的遗传规律；4、遗传标记的分型不受年龄、疾病及其他因素影响，终生不变；5、体细胞的稳定性，同一

7、个体的不同组织有相应的分型；6、具有遗传多态性，基因频率分布较均匀，父权排除率高；7、有可供使用并公开发表的群体遗传数据；8、遗传标记的突变率低；9、检验方法操作简单，重复性好，结果明确可靠。亲子鉴定效能的评估父权排除概率（power of excluding,PE）又称非父排除概率（probability of excluding paternity,PEP）是指通过某一个遗传标记系统的检测，将不是生父的被控父亲排除的概率。非父排除概率是衡量一个遗传标记系统排除非父能力的一个客观指标，是选择亲子鉴定遗传标记的依据和衡量从事亲子鉴定实验室的质量控制标准之一。各个遗传标记系统非父排除概率的大小取

8、决于该系统的遗传方式、等位基因数目以及各等位基因在群体中的频率分布。二、DNA多态性的分子基础DNA多态性的分子基础DNA的结构与功能结构：四种脱氧核糖核酸（简称核苷酸）通过磷酸二酯键聚合而成的多核苷酸链。核苷酸由磷酸、脱氧核糖和碱基（A、G、C、T）。功能：把遗传信息从亲代传给子代。DNA多态性的分子基础多态性：DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上形式，其本质是生物体在进化过程中DNA的核苷酸排列顺序改变的结果。DNA多态性可分为序列多态性（sequence polymorphism）和长度多态性（length polymorphism） 序 列 多 态 性在两条同源染色体上，同

9、源DNA序列长度相等，但其之间的序列存在差异。HLA基因区有极为复杂的高度可变序列。例如：HLA-DQA1区段有239bp，其中序列变异的位置有27个。 长 度 多 态 性是指由于片段插入、缺失或重复序列数目变异所致的DNA长度的个体差异。其中约占整个基因族2030的重复序列是导致DNA长度多态性的最常见原因。1、散在重复序列 2、串联重复序列 3、倒位重复序列第一代DNA遗传标记VNTR是由许多长度为770bp的串联重复单位组成的DNA序列，重复单位的重复次数在不同个体间有极大差异，重复次数少至数次，多至数千次，故又称为可变数目串联重复序列（variable number of tandem

10、 repeats，VNTRs）。以核心序列为探针进行限制性片段长度多态性分析时，能同时检测多个位点小卫星DNA多态性，这便是多位点DNA指纹图分析的理论基础之一。小卫星DNA重复单位的重复数目遵循孟德尔遗传规律遗传。第二代DNA遗传标记STR是一类更简单的寡核苷酸串联重复序列，重复单位为26bp，重复次数在1060次左右，又被称为短小串联重复序列（short tandem repeats，STRs）。STR分布广泛，在人类基因组中约存在着5万10万个。STR实质上也是一种VNTR，同样具有极高的多态性，亦按孟德尔遗传规律遗传。13 CODIS Core STR Loci with Chromo

11、somal PositionsCSF1POD5S818D21S11TH01TPOXD13S317D7S820D16S539D18S51D8S1179D3S1358FGAVWAAMELAMEL第三代DNA遗传标记SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性。1、SNP多态性低；2、SNP分布广泛；3、SNP遗传稳定；4、SNP分型容易。第三节 DNA遗传标记的检测技术Sample Obtained from Crime Scene or Paternity InvestigationBiologyDNAExtractionDNAQuantitationPCR Amplif

12、icationof Multiple STR markersTechnologySeparation and Detection of PCR Products(STR Alleles)Sample Genotype DeterminationGeneticsComparison of Sample Genotype to Other Sample ResultsIf match occurs, comparison of DNA profile to population databasesGeneration of Case Report with Probability of Rando

13、m MatchSteps in DNA Sample ProcessingSources of Biological EvidenceBloodSemenSalivaUrineHairTeethBoneTissueBlood stainOnly a very small amount of blood is needed to obtain a DNA profileDNA in the CellTarget Region for PCRchromosomecell nucleusDouble stranded DNA moleculeIndividual nucleotidesShort T

14、andem Repeats (STRs)the repeat region is variable between samples while the flanking regions where PCR primers bind are constant7 repeats8 repeatsAATGHomozygote = both alleles are the same lengthHeterozygote = alleles differ and can be resolved from one another170 bp195 bpDifferent primer sets produ

15、ce different PCR product sizes for the same STR alleleTCAT repeat unitIn 32 cycles at 100% efficiency, 1.07 billion copies of targeted DNA region are createdPCR Copies DNA Exponentially through Multiple Thermal CyclesOriginal DNA target regionThermal cycleThermal cycleThermal cycleMultiplex PCROver

16、10 Markers Can Be Copied at OnceSensitivities to levels less than 1 ng of DNAAbility to Handle Mixtures and Degraded SamplesDifferent Fluorescent Dyes Used to Distinguish STR Alleles with Overlapping Size RangesAn Example Forensic STR Multiplex KitD3FGAvWA5-FAM (blue)D13D5D7NED (yellow)AD8D21D18JOE

17、(green)GS500-internal lane standardROX (red)AmpFlSTR Profiler PlusKit available from PE Biosystems (Foster City, CA)9 STRs amplified along with sex-typing marker amelogenin in a single PCR reaction100 bp400 bp300 bp200 bpSize SeparationColor SeparationAvailable Kits for STR AnalysisKits make it easy

18、 for labs to just add DNA samples to a pre-made mix13 CODIS core lociProfiler Plus and COfiler (PE Applied Biosystems)PowerPlex 1.1 and 2.1 (Promega Corporation)Increased power of discriminationCTT (1994): 1 in 410SGM Plus (1999): 1 in 3 trillionPowerPlex 16 (2000): 1 in 2 x 1017ABI PRISM 310 Geneti

19、c Analyzer Automated gel pouringAutomated sample injectionCapillary electrophoresis with multi-color detection capabilitiesABI Prism 310 Genetic AnalyzercapillarySyringe with polymer solutionAutosampler trayOutlet bufferInjection electrodeInlet bufferClose-up of ABI Prism 310 Sample Loading AreaAuto

20、sampler TraySample VialsElectrodeCapillarySee Technology section for more information on CEamelogeninD19D3D8TH01VWAD21FGAD16D18D2amelogeninD19D3D8TH01VWAD21FGAD16D18D2Two different individualsDNA Size (base pairs)Results obtained in less than 5 hours with a spot of blood the size of a pinheadprobabi

21、lity of a random match: 1 in 3 trillion Human Identity Testing with Multiplex STRsSimultaneous Analysis of 10 STRs and Gender IDAmpFlSTR SGM Plus kitSTR genotyping is performed by comparison of sample data to allelic laddersMicrovariant alleleSTR Allele Frequencies05101520253035404567899.310Caucasia

22、ns (N=427)Blacks (N=414)Hispanics (N=414)TH01 Marker*Proc. Int. Sym. Hum. ID (Promega) 1997, p. 34Number of repeatsFrequencyBruker BIFLEX III Time-of-Flight Mass SpectrometerCapable of fully automated data acquisition on 384 or more samples per plate第四节 亲权鉴定的结果分析鉴定结论的证据条件（一）法律性1、鉴定主体2、鉴定程序3、鉴定客体（二）科

23、学性1、鉴定主体2、检验方法3、结果分析 遗传证据强度的判断指标父权指数（paternity index，PI）又称亲子关系指数，是假设父提供生父基因成为孩子生父的可能性与随机男子提供生父基因成为孩子生父可能性的比值，表示假设父为孩子生父的机会比随机男子为孩子生父的机会大多少倍，是一项重要的亲子关系参数。 PI=X/YX：假设父作为生父应提供所需基因的几率Y：随机男子作为生父应提供所需基因的几率父权指数是两个条件概率的比值，是一个典型的似然比，是以分型结果不违反遗传规律作为条件，假设父是孩子生父的概率与一个随机男子是孩子生父的概率之比。计算父权指数的具体步骤（1）根据母子组合，确定来自父母的必

24、需基因，即生父和生母基因。（2）确定母亲遗传生母基因的机会（f）。（3）确定随机男子提供生父基因的机会（g），一般使用相应的基因频率。（4）确定假设父提供生父基因的机会（c）。（5）计算随机男子成为生父的机会，Y=fg。（6）计算假设父成为生父的机会，X=fc。（7）计算父权指数，PI=X/Y=fc/fg。PI值的具体计算例见表10-11。 表10-11 PI值计算例案例表型必需基因f随机男人成为生父的机会（Y=fg）被控父成为生父的机会（X=fc）PI孩子母亲被控父母亲生父1BAABOB110.2556=0.255610.5=0.51.962ABABBABBA0.50.50.50.2556+

25、0.50.20920.50.596+0.501.280.23240.2983BBABBB或O0.4040.5960.25560.5960.50.87OB0.596 0.5960.5352+0.4040.25560.5960+0.4040.5 0.5748 0.54BOBOB110.2556=0.255610.596=0.5960.23 父权相对机会及计算父权相对机会（relative chance of paternity，RCP）又称亲子关系相对机会，是以百分比形式来表示PI值。RCP=PI/（PI1）100=X/（XY） 100PI理论值可接近无穷大，RCP理论值可非常接近100，但不能达

26、到100。RCP作为衡量亲生关系可能性大小的指标，按统计学标准，当RCP达到95，已具有肯定亲生关系的意义。亲子鉴定结果的评估排除亲权关系肯定亲权关系单亲亲子鉴定结果的评估排除亲权关系排除父权的类型（根据血型遗传规律）1、 直接排除2、间接排除直接排除有争议的可疑父亲与孩子中至少有一个为杂合子时，若他们之间的遗传标记违反遗传规律，排除亲子关系则为直接排除。 直接排除父权例DNA分型是直接检测染色体上的基因，由于各类DNA多态性位点的杂合度均较高，每个位点的等位基因又为共显性，故在没有基因突变、分型差错的前提下，只要受检者之间的DNA分型违反孟德尔遗传规律，可以认为都是直接排除。母亲孩子可疑父亲

27、例1A型AB型A型例2A型O型AB型 间接排除有争议的可疑父亲和孩子由表型推测均为纯合子时，如他们之间的遗传标记违反遗传规律，排除亲子关系则为间接排除。例 ：MN系统检测时，孩子为M型，可疑父亲为N型，推测孩子和可疑父亲的基因型分别为MM和NN，可疑父亲因不能提供必须的M基因而排除其与孩子的亲子关系。间接排除是根据检测的阴性结果推测某基因位点为纯合子，由于某些血型系统存在O基因、无效基因等，可能将含有这些基因的杂合子误推测为纯合子，故作出结论时应慎重。 排除父权的原则1、只有一个遗传标记（无论是血型遗传标记还是单基因位点DNA遗传标记）违反遗传规律，不能轻易作出否定结论，必须加测其他系统，因为

28、对于不是生父的男子，随着检测项目的增加必定还有其他遗传标记可排除亲子关系。若增加检测项目，排除遗传标记不再增加，则可考虑原来排除的那个遗传标记是由突变或非典型遗传方式造成的，此时若亲子关系相对机会已超过公认的亲权认定标准，则可作出认定结论。2、有2个遗传标记排除，要根据具体情况分析。2个血型遗传标记，如ABO、HLA违反遗传规律 ，则可作出排除结论 ；1个血型遗传标记直接排除，1个DNA遗传标记排除，且可疑父与孩子均为杂合子，则可否定可疑父为生父；2个DNA遗传标记排除需慎重对待，宜加测遗传标记后再具体分析，加测标记数目要考虑CCE值达到0.9999以上，结论较为稳妥。3、有3个及3个以上遗传

29、标记排除，则可作出排除亲子关系的结论。因为假设DNA单一基因位点突变率为0.002，三个位点同时突变造成错误排除概率仅为4109。排除案例：位点毛先生毛某1毛某2VWA15，1814，1614，17TPOX8，118，118，11THO16，66，99，9D16S53911，119，119，9D21S1128，33.229，3029，29D18S5119，2213，1913，19D8S117913，1515，2615，16D5S81811，1110，1212，12D13S3178，911，1212，13D7S8208，1011，1211，12CSF1PO11，1210，1210，12D3S13

30、5816，1912，1712，19FGA23，2422，2619，22 肯定亲权关系 在亲子鉴定中，根据多个血型系统检测结果的遗传关系分析，亲代与子代的遗传标记不违反孟德尔遗传定律，则他们之间可能存在亲生关系，但并不等于一定是亲生关系，因为随机男子也可能携有与生父相同的基因。经标准化实验检测遗传标记，假定为父亲的男子不能被排除父权的情况下，计算概率后如同时满足下列两项指标，可以认定假定父亲的父权，即可以断定他是孩子的生物学父亲。1、实验检测遗传标记的累积非父排除率等于或大于99.99；2、假定父亲的累积父权指数等于或大于10000，即在前概率相同的条件下，假定父亲的相对父权机会等于或大于99.99。肯定案例：位点韩女士孩子包某VWA16，1916，1717，17TPOX8，98，118，11THO19，99，9.38，9.3D16S5399，1010，1212，12D21S1128，3131，32.232，32.2D18S5115，1813，1513，18D8S117912，1312，1412，14D5S81811，1111，1212，12D13S3178，1111，1111，13D7S82012，1210，1210，10CSF1PO12，1211，121