125羟化维生素D3对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞侵袭、迁移和粘

1、1，25羟化维生素D3对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞侵袭、迁移和粘【摘要】目的讨论1，25羟化维生素D3骨化三醇对人高转移巨细胞肺癌PGL3细胞粘附、侵袭和迁移才能的影响。方法TT法检测其对PGL3细胞生长的影响；分别用粘附相关基底膜成分分析实验、重组基底膜侵袭实验、Transell室趋化运动模型研究骨化三醇对PGL3细胞的粘附、侵袭和运动才能的影响。结果骨化三醇明显抑制PGL3细胞的生长。骨化三醇作用PGL3细胞24h的I50值为0.158l/L。骨化三醇0.025、0.05、0.075l/L处理PGL3细胞24h，对PGL3细胞侵袭才能的抑制率分别为12.94%、27.33%、38.2

2、2%，对PGL3细胞运动才能的抑制率分别为8.70%、29.83%、43.62%。降低PGL3细胞对层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的粘附率，且其效果呈一定的剂量依赖关系。结论骨化三醇抑制人高转移巨细胞肺癌PGL3细胞的粘附、侵袭和迁移才能；骨化三醇对PGL3细胞粘附和侵袭的影响与其降低PGL3细胞对层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的粘附率有关。【关键词】1，25羟化维生素D3；粘附；侵袭;迁移；人高转移巨细胞肺癌PGL3细胞【Abstrat】bjetiveThisstudyasdesignedtinvestigatetheeffetsf1，25-dihydrxyvitainD3nadhesin，invasi

3、nandigratinfPGL3ells.ethdsellgrinhibitinaseasuredbyTTassay.Theeffetsf1，25H2vitD3nadhesin、invasinandigratinfPGL3ellseredeterinedusinganalysisfadhesin-relatedbaseentebranepnentsfibrnetinandlainin，renstitutedbaseentebraneinvasinassay，andTranselldel，respetively.Results1，25H2vitD3displayedgrthinhibitryat

4、ivityagainstPGL3ellsithI50valuesf0.158l/Lfr24hursftreatent.0.025，0.05and0.075l/Lf1，25-dihydrxyvitainD3inhibitedPGL3ellstinvadetherenstitutedbaseentebraneby12.94%，27.33%，38.22%，anddereasedtheperentagesfltinandigratinfPGL3ellsby8.70%，29.83%，43.62%.Inadditin，1，25-dihydrxyvitainD3inhibitedPGL3ellstadher

5、etthebaseentebranepnentsfibrnetinandlainin.nlusin1，25-dihydrxyvitainD3ansignifiantlyinhibittheadhesin，invasinandigratinfPGL3ells，andthesuppressinfadhesinfPGL3ellstfibrnetinandlaininayberespnsiblefrtheinhibitinfadhesinandinvasinfPGL3ells.【Keyrds】1，25-dihydrxyvitainD3;adhesin;invasin;igratin;PGL3ells侵

6、袭和转移是不断改良性肿瘤最重要的恶性行为和治疗的主要障碍，是临床90%以上癌症患者的致死因素，因此，控制侵袭和转移成为恶性肿瘤患者预后的关键因素，研发具有抗肿瘤转移的新药有着非常重要的意义。1，25羟化维生素D31，25-dihydrxyvitainD3又名骨化三醇，是维生素DVitainD，VitD在肝脏和肾脏羟化酶的作用下最终被转化为其活性形式。近几年来其对肿瘤细胞的影响备受关注。骨化三醇对体外培养的几乎所有类型的肿瘤细胞有抑制或促分化作用，并且可以抑制、杀死或预防体内多种肿瘤15。但其对肿瘤的作用机制尚未完全明确，最近的研究结果说明骨化三醇的抗肿瘤作用与其抑制肿瘤细胞转移、侵袭和血管生成

7、相关。目前，骨化三醇对人高转移巨细胞肺癌PGL3细胞转移才能的影响还未见报道。本文对骨化三醇对人PGL3细胞生长增殖、侵袭、运动和粘附才能的影响进展研究，为将其开发成为有效的临床抗肿瘤转移药提供理论根据。1材料与方法1.1材料与试剂1，25H2VitD3、TT、纤维粘连蛋白fibrnetin，FN、苏木精、伊红、优凯特均购自Siga公司；超级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料；RPI-1640购自美国Hylne公司；层粘连蛋白lainin，LN购自北京大学医学部病理系；胰酶购自美国Gib公司；Transell室直径6.5、孔径8购自美国star公司；聚碳酸酯膜直径13、孔径8购自美国il

8、lipre公司；胶原购自华美生物工程公司。其余试剂均为国产分析纯。人高转移巨细胞肺癌PGL3细胞引自北京大学医学部病理系。1.2方法1.2.1细胞培养PGL3细胞培养于含10%小牛血清，100ku/L青霉素和100g/L链霉素的RPI-1640培养液中，37、5%2饱和湿度细胞培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。1.2.2TT法检测骨化三醇对PGL3细胞生长的影响取对数生长期细胞，接种于96孔板，每孔接种100l含5.0103细胞。培养过夜后，吸出培养液，参加新培养液90l，及不同浓度的骨化三醇溶液10l，使终浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20l/L。对照组那么参加一样体积的培

9、养液，每一浓度设8个平行孔。继续培养24h。每孔参加TT5g/L20l，培养46h。每孔参加三联液DS100l。用ELX800型酶标仪在570n波长处测量D值，以Bliss法计算半数抑制浓度。1.2.3细胞侵袭实验Transell室朝上室方向的上膜面已铺好atrigel，朝下室方向的下膜面涂纤维粘连蛋白10l约2g，风干后放入已含有600l含0.1%牛血清白蛋白BSA的RPI-1640培养液的下小室中，37孵育1h，取出备用。将经0.025、0.05、0.075l/L骨化三醇处理24h的PGL3细胞重悬于含0.1%BSA的RPI-1640培养液中，调整细胞浓度为1.0109个/L，加100l细

10、胞悬液于Transell室的上小室。对照组为未经骨化三醇处理的PGL3细胞，每组设3个平行孔。在细胞培养箱孵育6h。取出上小室，甲醇固定3in，苏木精染色3in，水洗。伊红染色10s，水洗。擦去上膜面的atrigel及未穿过膜的细胞，优凯特胶封片。在400倍光学显微镜下随机选择6个视野，计数每个视野穿过膜的细胞数。计算平均值，以穿过膜的细胞相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭才能。侵袭抑制率=1实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数100%。1.2.4细胞运动实验除膜上不涂纤维粘连蛋白外，其余方法步骤同1.2.3。1.2.5细胞与FN、LN的粘附实验分别将5.0gFN、LN铺于96孔板。用50l含2%BS

11、A的RPI-1640培养液封闭1h，PBS洗2次，待用。将经0.025、0.05、0.075l/L骨化三醇处理24h的PGL3细胞重悬于含0.1%BSA的无血清RPI-1640培养液中，调整细胞浓度为8108个/L，每孔加100l细胞悬液，对照组为未经骨化三醇处理过的PGL3细胞，每一浓度设8个平行孔。37孵育1h，吸去培养液，每孔参加200l预热的PBS洗去未粘附细胞。每孔参加100lTT0.1g，调零孔无细胞，于培养箱中继续培养4h后，每孔参加100lDS，用ELX800型酶标仪在570n波长处测量D值，细胞粘附率按下式计算。细胞粘附率=实验组D值/对照组D值100%。1.2.6统计学处理

12、数据采用均数标准差xs表示，结果用Studentsttest进展统计分析。2结果2.1骨化三醇对人高转移巨细胞肺癌PGL3生长的抑制作用结果说明，骨化三醇可明显抑制PGL3细胞的生长。骨化三醇作用PGL3细胞24h的I50为0.158l/L见表1。表1不同浓度骨三醇对PGL3的生长抑制作用xs注：与对照组比拟，*P0.0012.2骨化三醇对PGL3细胞侵袭才能的影响经骨化三醇0.025、0.050、0.075l/L作用24h后，PGL3细胞侵袭重组基底膜的才能明显受到抑制，抑制率分别为12.94%、27.33%、38.22%见表2。表2骨化三醇对PGL3细胞侵袭才能的影响xs注：与对照组比拟，

13、*P0.012.3骨化三醇对PGL3细胞运动才能的影响骨化三醇0.025、0.050、0.075l/L作用PGL3细胞24h后，能抑制PGL3细胞的运动才能，且呈剂量依赖性，抑制率分别为8.70%、29.83%、43.62%表3。表3骨化三醇对PGL3细胞运动才能的影响xs注：与对照组比拟，*P0.012.4骨化三醇对PGL3细胞与FN、LN粘附才能的影响见图1。图1骨化三醇对PGL3细胞FN、LN粘附才能的影响由图1看出0.025、0.050、0.075l/L的骨化三醇作用PGL3细胞24h后能降低PGL3细胞对基质成分LN、FN的粘附率，并呈一定的剂量依赖关系。3讨论本实验结果说明骨化三醇

14、能明显抑制PGL3细胞生长，作用PGL3细胞24h后的I50为0.158l/L。而抗肿瘤侵袭、运动和粘附才能的药物其对肿瘤细胞的细胞毒作用应控制在10%左右，因此，选择0.025、0.050、0.075l/L骨化三醇来进展实验。这三个浓度的骨化三醇对PGL3细胞的生长无明显影响抑制率10%，但经实验说明可降低PGL3细胞的侵袭才能，这说明骨化三醇抑制PGL3细胞侵袭、粘附和迁移可能与其细胞毒作用无直接关系。近年来，肿瘤的侵袭转移机制的研究在细胞和分子程度上已获得了一不定期的进展。Litta等提出侵袭过程分为“三步：粘附、降解基底膜和基质运动。上述三步重复进展，使得肿瘤细胞向深层侵袭。0.075

15、l/L骨化三醇即可明显抑制PGL3细胞侵袭才能抑制率38.22%和细胞趋向性运动才能抑制率43.62%，并能降低PGL3细胞与细胞外基质成分FN、LN的粘附。因此，上述几项实验结果说明骨化三醇是通过抑制细胞粘附、运动而抑制PGL3细胞的体外侵袭才能的。【参考文献】1PurghlaiH，AkhterJ，LuY，etal.Invitrandinvivinhibitinfliveranerellsby1，25-dihydrxyvitainD3.anerLett，2000，1511:97-102.2KshizudaK，Kike，AsuH，etal.binedeffetfvitainD3analgsandpalitaxelinthegrthfF-7breastanerellsinviv.BreastanerResTreat，1999，532:113-120.3NivY，SperberAD，FigerA，etal.Inlretalarinapatients，seruvitainDlevelsvaryardinggstagefthearina.aner，1999，863:391-397.4