单核苷酸多态性及其应用详解演示文稿

1、单核苷酸多态性及其应用详解演示文稿第一页，共三十九页。优选单核苷酸多态性及其应用第二页，共三十九页。Single nucleotide polymorphism第三页，共三十九页。SNP的特征 SNP是人类可遗传的变异中最常出现的一种，占所有已知多态性的90%以上，在人类基因组中广泛存在，人类DNA中每300-1000bp就有一个SNP. 因此，一个人类个体大约携带300万-1000万个SNPs。 第四页，共三十九页。SNP的特征 一个SNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化， 作为一种碱基的替换，大多数为转换（CT，GA），也可能是颠换。 具有转换型变异的SNP约占SNP总量的23左右。

2、 转换的发生率总是明显高于其它几种变异，而且在CG序列上出现最为频繁，多是发生CT的转换，原因是CG中的C是甲基化的，它能自发的脱氨基而替换为胸腺嘧啶。第五页，共三十九页。 SNP大都表现为二等位基因（bialletic)多态性,即在该位置只存在两种不同的碱基。 位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型(haplotype)，相邻SNPs的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代.第六页，共三十九页。第七页，共三十九页。根据SNP在基因组中的分布位置可分为: 基因编码区SNP(cSNP) 基因调控区SNP(pSNP) 基因间随机编码区SNP(rSNP) 等三类。 因为编码区内的变

3、异率占周围序列的1/5，cRNP的总量显著少于其他两类SNPs。第八页，共三十九页。 cSNP又可分为2种： 同义cSNP(synonymous cSNP)： 非同义cSNP(non-synonymous cSNP)第九页，共三十九页。同义cSNP： SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同；非同义cSNP： 指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。这种改变常常是导致生物性状改变的直接原因。 位于基因调控区的SNP则会影响基因表达量的多少，因此，这两类SNP在功能和疾病发生发展方面具有更重要的意义。第十

4、页，共三十九页。SNP的检测方法 单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP) 原理： 单链DNA的折叠结构是由单核苷酸序列决定的，当某一个碱基发生突变时，便会直接影响该链的构象，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移率会发生改变。第十一页，共三十九页。SNP的检测方法变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE) 原理: 当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链

5、，因影响电泳速度变化的程度而被分离。 第十二页，共三十九页。SNP的检测方法 Taqman法 以荧光共振能量传递(fluorescent resonance energy transfer,FRET)为基础的检测方法。 在PCR反应中，将供者-受者染料对分别结合到Taqman探针的两端，探针未与目标序列结合时，通过FRET作用使供者不发荧光；完全互补配对后，由于Taq DNA聚合酶具有5核酸酶的活性，可将供者从探针上切下来从而发出荧光。如果探针与目标序列中存在错配碱基，就会减少探针与目标序列结合的紧密程度及Taq DNA聚合酶切割供者的活性，也就影响了供者的荧光释放量，从而使碱基突变链和正常链

6、得以区分。第十三页，共三十九页。 供者受者5 3 Taqman 探针第十四页，共三十九页。 供者受者5 3 Taqman 探针第十五页，共三十九页。 供者受者5 3 引物目标序列第十六页，共三十九页。受者5 3 引物 供者目标序列第十七页，共三十九页。SNP的检测方法 分子信标(molecular beacon)法 分子信标是一个U型的单链核苷酸探针（探针序列内部可有一定程度的互补配对），在探针两端也加上供者-受者染料对，U型探针使两染料靠近，通过FRET作用使供者不发荧光。当探针与目标序列完全互补配对后，两染料分离，使得供者的荧光亮增加，如果目标序列中存在错配碱基，就会影响探针与其结合，从而

7、影响到供者的荧光亮，使碱基突变链和正常链得以区分。第十八页，共三十九页。供者受者第十九页，共三十九页。 供者受者第二十页，共三十九页。焦磷酸测序法 焦磷酸测序法(pyrosequencing)是一种不依赖平板胶或毛细管电泳，不依赖DNA的荧光标记/激发/检测体系的序列分析技术，适用于已知序列的DNA片段进行验证分析，适用于已知SNP的序列验证及基因分型。 第二十一页，共三十九页。 焦磷酸测序法主要是由四种酶催化同一反应体系中的酶级联反应: 包括DNA聚合酶、硫酸化酶、萤光素酶和双磷酸酶; 反应底物为adenosine 5phosphosulfate(APS)和萤光素。 反应体系还包括待测序的D

8、NA单链和测序引物。 第二十二页，共三十九页。在每一轮测序反应中，加入一种dNTP。 如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团(PPi)。 掺入的dNTP和释放的焦磷酸的物质的量相等，反应时dATP由deoxyadenosine alfa-thio triphosphale(dATPaS)替代 因为DNA聚合酶对dATPaS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATP是萤光素酶的底物，dATPctS不是。 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，其物质的量和焦磷酸一致。第二十三页，共三十九页。 ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素(oxyluclf

9、erin)的转化，氧化萤光素发出与ATP含量成正比的可见光信号。 光信号由CCD摄像机检测并通过相应的软件得到反映。 每个峰的高度(光信号）与反应中掺入的核苷酸数成正比，ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，猝灭光信号，并再生反应体系，加入另一种dNTP进行下一轮反应。随着以上过程的循环进行，互补DNA链合成，DNA序列信号峰确定。 该技术分析系统自动化程度高，通量大，速度快，易于建立标准化操作，适合大规模SNP研究及基因分型。第二十四页，共三十九页。第二十五页，共三十九页。SNP的检测方法 动态等位基因特异性杂交法(dynamic allele specific hybridization

10、,DASH) 用生物素标记一条引物进行目的DNA扩增，PCR产物经生物素结合于链亲和素包裹的微孔板壁，不带生物素标记的链用碱洗掉。加入探针和荧光染料，荧光染料SYBR Green可特异性地插入双链中，在激发光的作用下发出荧光，而在单链中则不能；探针和产物单链杂交后，在仪中微孔板持续缓慢升温，同时连续检测各孔中荧光强度，将温度及各孔中对应的荧光强度输入计算机, 基因型与探针完全匹配的样品在较高温度才解链,因此在较高温度才得到d(Fluorescence)/dt峰;与探针不完全匹配的样品则在较低温度时就得到d(Fluorescence)/dt峰，杂合子则得到两个峰。 第二十六页，共三十九页。PCR

11、扩增第二十七页，共三十九页。链亲和素包裹的微孔板 + 碱变性第二十八页，共三十九页。持续缓慢升温第二十九页，共三十九页。 第三十页，共三十九页。SNP的检测方法 变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC) 原理第三十一页，共三十九页。第三十二页，共三十九页。第三十三页，共三十九页。第三十四页，共三十九页。第三十五页，共三十九页。SNP的检测方法 -质谱分析法(matrix-assisted laser desorption/ionization time-flight mass spectrometry)

12、 原理 ：适当大小的有机分子晶体(介质)用接近其吸收光谱的激光瞬时激发，会发生能量转移及解吸附过程。如将低浓度的蛋白质或核酸分子加入介质溶液中并加以干燥，蛋白质或核酸分子将嵌入到介质晶体中。将该晶体放入质谱仪的真空小室，用瞬时(纳秒)强激光激发，晶体中的蛋白质或核酸分子就会解吸附，转变成气相的离子态，此时可通过质谱分析这些离子。 第三十六页，共三十九页。SNP的检测方法 DNA芯片技术（DNA chip） 将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1块集成电路板上，彼此之间重叠1个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与2块DNA芯片杂交，由于至少存在1个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变，该方法快速简单、片动化程度高，具有很大的发展潜力，将在基因突变检测中心发挥非常重要的作用。 第三十七页，共三十九页。SNP的应用 SNP作图 利用SNP图谱搜寻遗传致病基因 SNP在药物设计中的作用 SNP在法医学中的应用