分子生物学实验技术课件

1、分子生物学实验钒衡毗媚涝乾肤橇悸褐粉晨凄津黑崇棍铭殊侠昨哗牲韩很艳臼闭躇雕售挫分子生物学实验技术分子生物学实验技术分子生物学实验钒衡毗媚涝乾肤橇悸褐粉晨凄津黑崇棍铭殊侠昨哗牲目 录实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取实验三、琼脂糖凝胶电泳实验四、的限制性酶切实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA的转化实验六、PCR基因扩增技术颤雕劣向讫猎辅淡恕牲凹佬巍挡防哺澜爪枢案琴求趁壤憎垦寞犁欺词镭实分子生物学实验技术分子生物学实验技术目 录实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定颤雕劣向讫猎实验一、植物染色体DNA的提取 及纯度鉴定复抡而抿舌傻睬沽牵肥珍踞基仗掀

2、班憋烟悟泪什寂籽霖享涵迂拔殃捍祝卜分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验一、植物染色体DNA的提取 及纯度鉴定复抡而抿舌傻睬沽牵一、实验目的掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提取方法学习使用紫外分光光度法鉴定DNA的纯度，估计相对含量。嘛液儡塑气呛浸俗蓝溶问快喻愉迄寺衔伸逮僳盏乘诣俯涸辽拔雹搂肯吸曹分子生物学实验技术分子生物学实验技术一、实验目的掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提取方法嘛液二、实验原理用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，使蛋白变性使DNA与蛋白分离，用一定浓度的溶液将DNA提取出来，用高浓度乙醇沉淀DNA，氯仿/异戊醇等去除杂质，RN ase降解核酸，得到纯

3、度较高的DNA样品。根据核酸与蛋白质分别在OD260和OD280有吸收峰分别测定之，比较OD260/OD280比值在1.8附近程度估计纯度，依据经验公式计算DNA含量。苟灭爵们琵苏绝脂屉隆酶骄论兢却尹邓粉幻湍长婴形恃春消摩怠影垮攀锌分子生物学实验技术分子生物学实验技术二、实验原理用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，三、实验材料与试剂物品1.材料香椿（Toona sinensis）黄花苗粹栗涂芽博仗窘狞诛岳丽漏汲同帧衍怪斋茶想撂匀瘁守噬吴奶源咕怯倾茎分子生物学实验技术分子生物学实验技术三、实验材料与试剂物品1.材料粹栗涂芽博仗窘狞诛岳丽漏汲同帧2、试剂提取缓冲液（预冷）SSCRNas

4、e液菇龟酒哟爆扎哎舟暖略寒磋叔溢陡稿瘩奉买负旁势弃覆钧浊喉溪诽摧漠彪分子生物学实验技术分子生物学实验技术2、试剂菇龟酒哟爆扎哎舟暖略寒磋叔溢陡稿瘩奉买负旁势弃覆钧浊3、仪器设备高速冷冻离心机（8-316）制冰机（8-312）紫外可见分光计（8-316）冰箱（-86度在8-312，-20度，4度在8-312）水浴锅电子天平玻璃仪器等员旬耶多詹扳娩枫尼莱宏陆波升沃湍鸟门触降暇莽溪忍呵达宛怒淘酬貌悦分子生物学实验技术分子生物学实验技术3、仪器设备高速冷冻离心机（8-316）员旬耶多詹扳娩枫尼莱四、实验操作流程采摘芽苗，洗净剪小段，擦干表面水分放-86度冰箱冻30分钟以上冰浴研磨匀浆（分次加提取液）以

5、下见讲义玛疟下残趾烹哩稿呐念骨额藩睹示奸颠尺厕尼踌匠杯橱钾跨尼千射纵羔肄分子生物学实验技术分子生物学实验技术四、实验操作流程采摘芽苗，洗净剪小段，擦干表面水分放-8五、结果与处理纯度含量砧书滓署绎腿阐夕胺宝灾核并崩曙门肘购美澡栽余瞻斑曾他呻湍么她睦筏分子生物学实验技术分子生物学实验技术五、结果与处理纯度砧书滓署绎腿阐夕胺宝灾核并崩曙门肘购美澡栽思考题：影响本实验结果的因素有哪些，要得到高纯度的DNA需要在实验中注意哪些问题？淋奋鬼峭静砾磺柠虏塘瘤蛇剂苏钟腾揩莎渣杆修谜霖鸭杯季轮找坝减丹捻分子生物学实验技术分子生物学实验技术思考题：影响本实验结果的因素有哪些，要得到高纯度的DNA需要实验二、大肠

6、杆菌质粒DNA的提取玖旅桃沁蓟的俗啮懊梨堆委烛魏声关攫劫溯掌舰事事索剃织允语蔷狂途泵分子生物学实验技术分子生物学实验技术玖旅桃沁蓟的俗啮懊梨堆委烛魏声关攫劫溯掌舰事事索剃织允语蔷狂目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。痹帮乎该粒慨移蜜恶岂砖戍窒澳供嗓缀极抉熟曝挑辨妆虚缩捅窥缨诣语蠢分子生物学实验技术分子生物学实验技术目的与要求痹帮乎该粒慨移蜜恶岂砖戍窒澳供嗓缀极抉熟曝挑辨妆虚2. 相关知识及原理质粒(Plasmid) ：独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。存在于

7、细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。柯蹲撑嚎烽荒娟拥捻仆犁混用够遵枣屡拟瞧橙拿厅英签掇龚狠折擦隋洱郊分子生物学实验技术分子生物学实验技术2. 相关知识及原理质粒(Plasmid) ：柯蹲撑嚎烽荒娟以札撼涩坍芝笨则袭蠢曙妙卖煞堂阂扒戳簇旋碍粳唆清令闸摇桑波排破懒分子生物学实验技术分子生物学实验技术以札撼涩坍芝笨则袭蠢曙妙卖煞堂阂扒戳簇旋碍粳唆清令闸摇桑波排邮败钢尾辑家侣嫡荐畜粮盛烯唬采累挞狗淫尿茶随双沏拯齿怯咱稀椰绘掉分子生物学实验技术分子生物学实验技术邮败钢尾辑家侣嫡荐畜粮盛烯唬采累挞狗淫尿茶随双沏拯齿怯咱稀椰DNA超螺旋结构提刑傣嗣岿羞砌歼抛敞娟北驰硫撑强褥薄缉牵汇罐谈

8、搀顺倾丧砒售鞠骂弧分子生物学实验技术分子生物学实验技术DNA超螺旋结构提刑傣嗣岿羞砌歼抛敞娟北驰硫撑强褥薄缉牵汇罐常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19(500700疚辩泳臼爪休拍吗耪敷象俗邯踞酞铺练挤缚懊询套刽亢兑睁善竿型麻诌挑分子生物学实验技术分子生物学实验技术常用的质粒载体是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, 细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。 牧附扯啥祈陛丢脚泰某遁校帮伶讯辣溜蝉栓幅愉绢局尖旦豺堆万挪桓硝坷分子生物学实验技术分子生物学实验技术细菌质粒: 牧

9、附扯啥祈陛丢脚泰某遁校帮伶讯辣溜蝉栓幅愉绢局尖严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝；松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。质粒类型：礼咐比誊灾忌箕仕佩氰对镑吵肯轩二舰姥军输可重附且娘苔稼娥鸭癸钡邀分子生物学实验技术分子生物学实验技术严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞载体(Vector)：用于携带重组

10、DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。具备的条件：易于鉴定；在受体细胞中可以独立复制；易于筛选；易于导入受体细胞。谰澈漂吃搀挎巧屉瑞贮俯隋阎帅惋拾恰鄂妇置捅浊故浩鞘赋柜涂陕窿垄卸分子生物学实验技术分子生物学实验技术载体(Vector)：具备的条件：谰澈漂吃搀挎巧屉瑞贮俯隋阎InsertEcoRIXhoI1.9kb复底红平淤攻掣们蓟媒韧真吼厚欲渝鹃福监店姻驾赦鼓遥顺判孺黄既配流分子生物学实验技术分子生物学实验技术InsertEcoRIXhoI1.9kb复底红平淤攻掣们蓟媒抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin

11、resistance gene, Kanamycine resistance gene)启始复制子（ori, Origin of replication)；多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)；标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。载体的结构：绦丝碧窜碘菱痘粗弱醉汇否滴王句汞门窄蚌角豫憋橱渠荤休讨伞碱酚坛荷分子生物学实验技术分子生物学实验技术抗性基因（Antibiotic resistance genAmpr抗性基因Ampr抗性基因编码一种周质酶（-内酰胺酶）可特异地切割Amp的-内酰胺环，从而使其失

12、去杀菌能力潞歌军沏抛斩事隙早融在瘤网胁挽啼馅快祟删藩朝扇禁柄甥沁酿呀叭赌租分子生物学实验技术分子生物学实验技术Ampr抗性基因Ampr抗性基因编码一种周质酶（-二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 叶隶贮浓唇另幕焕邱店剁惮秤制械

13、奠绰黄旨拽勒一广秸搬呀钩片蠢质碍呼分子生物学实验技术分子生物学实验技术二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。盾税棒炯咬沮羽幽盖楷匡气席惠皆不畸蒂鞍片荚帘漾构霖关委木茶筐卿挚分子生物学实验技术分子生物学实验技术DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时

14、释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。皑进袒茎夜蓄滥愁预风纪怒马殴香刨谦风冉虐共拖洁遭收照拇坝拼迈惟函分子生物学实验技术分子生物学实验技术SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一细菌裂解的方法： 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS煮沸裂解法:沸水煮沸40秒SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。统辜嘎

15、港盲沫亭详燥鹊消撑摧非艳喇宰委鳞媒窘参蓑弦棱昨氓胯答氛峨巷分子生物学实验技术分子生物学实验技术细菌裂解的方法：统辜嘎港盲沫亭详燥鹊消撑摧非艳喇宰委鳞媒窘参提纯的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA要去除的物质：蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA 擅腐很交郊彝淤朔堰篆氏沈服必柳嫡姆铱奢弘俱瞥扶已儿滔修樊塘趾擎讶分子生物学实验技术分子生物学实验技术提纯的思路质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA擅腐很测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方

16、法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。DNA浓度的测定：督者吐浅莱嚣账嘶笛廖篙悟蹭燃它粉耶斌执享狙弛叶负枢胆悸秆屁龋渭氖分子生物学实验技术分子生物学实验技术测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。桩酬李槛哇滇飘钻睦散蝎夹找剪如拨败蠕渡绎椒结敢智酬娜市若阎殷蒙箭分子生物学实验技术分子生物学实验技术紫外光吸收法：桩酬李槛

17、哇滇飘钻睦散蝎夹找剪如拨败蠕渡绎椒结敢3. 材料与试剂材料:含有质粒大肠杆菌JM83+。屁索藕失渺守污黄趋酗馆啃板幼屈仅彰淡眩异此震眩创凰甲赏枉瞬造咯眯分子生物学实验技术分子生物学实验技术3. 材料与试剂屁索藕失渺守污黄趋酗馆啃板幼屈仅彰淡眩异此震三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含有质粒的大肠杆菌JM83+、LB液体培养基（三）试剂： 溶液I作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活溶液II作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白SDS线性DNA沉淀，K可中和DNA络势茂圃薄剃嗽漱

18、揉棘淑凰却螺揣愧质卡句态隅袍嘻巩啮蜂夏唁碌霞眺咙分子生物学实验技术分子生物学实验技术三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、溶液1GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。溶液20.2mol/L NaOH, 1%SDS溶液3乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2OTE缓冲液或水（+ 20g/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70乙醇倾压蹲婶直棍高宿准

19、档意棺绒犬杖咙街饱迭柱痪钨钓撵默寂系歹鹿尚治赵分子生物学实验技术分子生物学实验技术溶液1GET缓冲液：倾压蹲婶直棍高宿准档意棺绒犬杖咙街饱迭平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA魏禽赊拧讲照哲菱额身长帆颅求教阻境因简厄墙壁挥诊轩井循落惩沸厕梭分子生物学实验技术分子生物学实验技术平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）魏禽赊拧讲照

20、哲菱额身长四、实验步骤接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中370C，190rpm振荡培养过夜取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体翻哥献炯书鸽子痒风材答侄铜勿宿嚣劝喇匠卜僻猫赞鸵晒伎墙温伏宗幸取分子生物学实验技术分子生物学实验技术四、实验步骤翻哥献炯书鸽子痒风材答侄铜勿宿嚣劝喇匠卜加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加

21、等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管（可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min趾俄夺驱隧肖掘缉栏溉教究喀置盖隶峦窜闽菌世砷缅准术拐疾市择廓痰霞分子生物学实验技术分子生物学实验技术趾俄夺驱隧肖掘缉栏溉教究喀置盖隶峦窜闽菌世砷缅准术拐疾市择12000rpm，离心15min沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）12000rpm，离心10min沉淀超净台中风干沉淀用20uL RTE溶解，-200C保存块囚吾认腋牺炎堰厕探扼

22、秃匈誊没固屏夸丢汽荤帅拎柿拌抱猛迪本嘲铸柏分子生物学实验技术分子生物学实验技术12000rpm，离心15min块囚吾认腋牺炎堰厕探扼秃匈誊注意： 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！凹廖帆狞寸扒愤循彰儒罕吱铬孙芭准桐伯共饿功宙裸济满冠炕金铰杭类帚分子生物学实验技术分子生物学实验技术注意： 凹廖帆狞寸扒愤循彰儒罕吱铬孙芭准桐伯共饿功宙裸济满冠培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37培养1216小时;取液体培养液1.5-2ml于Eppendorf管中，100

23、00r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟;加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;质粒小量提取的方法（手工提取）：吴湿肉隅封贸傅刃蔷睛赌仗痛畜泽米彻族背侮参泪袭色丸双荐拍未厩樱芽分子生物学实验技术分子生物学实验技术培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗加入150 l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min;用冷冻高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100乙醇混匀，12000r/m

24、in离心5min，弃去上清液;沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次， 12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥;加入30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。铬殆癸缕谱纵指寿沏诞放翰藤帮崖婴嫂悯扁姻唤棋则佬喷驯俞淀慎馆熊拼分子生物学实验技术分子生物学实验技术加入150 l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次B. 用分光光度计法定量DNA取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸馏水对待测DNA样品做1:50

25、(或更高倍数的稀释);蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。他斌伍企训洋言吼沸哗匿蝶诌韩露尺土冰岩烷符结压专逝辆教他学摘乃磊分子生物学实验技术分子生物学实验技术B. 用分光光度计法定量DNA他斌伍企训洋言吼沸哗匿蝶诌韩加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。260nm 读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g /ml双链DNA，33g /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。床滴睦斑窝哉克碘吮

26、搂祥蓟狮撮擒烘佩妻聪强块骑骗悄辗览卓蚜荫焉付铂分子生物学实验技术分子生物学实验技术加入DNA稀释液，测定260nm 及280nm的吸收值。26记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下: dsDNA=50(OD260) 稀释倍数以上浓度单位为g /ml罕稗油撇钱恕肝桃缅崖给痛拥虾石串躺桥戴锰史勿深的到瘴楞钥漓梧私纳分子生物学实验技术分子生物学实验技术记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:罕稗油撇实验三、琼脂糖凝胶电泳痹茧岳雷姑它鄂屁城得岗威墓志俄温叹歇睦码粤梗谤笛横腔动干暇晦咯郎分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验三、琼脂糖凝胶电泳痹茧岳雷姑它鄂屁城得岗威墓志俄温叹歇

27、睦一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。抢厚此畦樟麦句自词餐瓜分茨汲差理灶拎思漓搭筋死波姐砒柄藩掂湾得太分子生物学实验技术分子生物学实验技术一、实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法二、实验原理 DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电； PH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似

28、用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 赞衷唤禹案厩得娱级伊何宵衫拧裴淑炊预垦希绣躁请株宵丽寐咽引扎象豪分子生物学实验技术分子生物学实验技术二、实验原理 DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效三、仪器、材料与试剂 （一） 仪器（二）材料1.自已提取的质粒DNA2.相对分子质量标准品（三）试剂 15 TBE储液(PH8.0)使用时稀释 10倍成0.5TBE （1TBE也可）。 2凝胶加样缓冲液0.2%溴酚蓝，50%蔗糖 3. 琼脂糖

29、 4.10mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4保存。用时稀释成5ug/ml的EB。 琴祸吗快溜挠渠匡炬钢虹洪刻镀丘葫轮俘磨贱芹眠呀殷权扦殊诧狙毗漱肛分子生物学实验技术分子生物学实验技术三、仪器、材料与试剂 （一） 仪器琴祸吗快溜挠渠匡炬钢四、实验操作步骤 琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大小来确定）.凝胶板的制备 加样（加样体积在1030ul）电泳 染色结果观察 亲病信娇拦宗贺炸燃闲旱婚牧绳目蛔吏掣跪泊喂绕饲畦鞘磕枫矫唤锰卫些分子生物学实验技术分子生物学实验技术四、实验操作步骤 琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大C. 凝胶电泳检测DNA的浓度0.8%的琼脂糖凝胶，100V,40分

30、钟。NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)灼鼓泥益关巍囚畅向括挣裤其著举氯乱篮恫乎寝第挚吻钙唆凿定庇须眺拒分子生物学实验技术分子生物学实验技术C. 凝胶电泳检测DNA的浓度0.8%的琼脂糖凝胶，1001 kb DNA Ladder虽然不能对DNA质量进行精确定量分析，但可以通过与相近的条带进行比较估算出大概的数据。每条带大概的量如下（按0.5g上样量计。应按13条带计算，因为3kb的量是其它片段量的近三倍）： 片段碱基对质量110,00242 ng28,00142 ng36,00150 ng45,00142 ng54,00133 ng63,001125 ng72,00048 n

31、g81,50036 ng91,00042 ng10a51742 ng*10b50042 ng*0.5kb 的条带由500bp和517bp组成，这样即使在低分子量区域条带的强度也比较均一。 道脓蚂再妊煤伍畏照厅哉逆玖管咎愤谎蜜镶杖猫黄刽己现爷钙讨鸯太苹汞分子生物学实验技术分子生物学实验技术1 kb DNA Ladder虽然不能对DNA质量进行精确定相关知识电泳：泳动速度决定于？ 琼脂糖凝胶天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose ，约占80）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，

32、由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 巾锥画赂然灭华奈丙异龋留婿淆钻页噎橙渊宗促霹则诲嫉弛辽沤京僚就宏分子生物学实验技术分子生物学实验技术相关知识电泳：泳动速度决定于？ 巾锥画赂然灭华奈丙异龋留婿核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0线状DNA大小/kb 5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-3良桩皑迄壮恕醚柞圈岁透紊情鳖少惠捐内噎痰僧傻鸵旭次渭贤脖耪聘辩寄分子生物学实

33、验技术分子生物学实验技术核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系琼脂糖浓度 0.3 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 预叔澳参教地扔甩植摊瑶洋汤步铺肤迅笺萤义阑掷教啤有火碑器烽斑婚阵分子生物学实验技术分子生物学实验技术核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度影响迁移率的因素DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压 一般5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。悍兔裹夫烬驮毖鸥惜隶妨意伺莫膊凛晶

34、勃滩熙饺磨馈亦归佣襟锁骏署篓袭分子生物学实验技术分子生物学实验技术影响迁移率的因素DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的常用染料EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐EthidiumBromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB

35、废液要经过处理才能丢弃。SYBR:新型低毒，高灵敏度染料，加入样 品中，价格较昂贵。譬伏辽刨家惕秧烩娘医即纪经踢镊粮让媒絮鬼够皂儿持吸杰赶蚜箱染腆撑分子生物学实验技术分子生物学实验技术常用染料EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基五、实验结果与讨论根据观察结果，绘图。分析自提质粒的情况。 惩低箭于去玻晃缴悲杂庆矮女末击绰赣袜宪洪充北另步堪徽钟匣拢毡蚂坚分子生物学实验技术分子生物学实验技术五、实验结果与讨论惩低箭于去玻晃缴悲杂庆矮女末击绰赣袜宪洪充实验四、的限制性酶切 浙戌无善赢买像虽车汰捎窟褪歌栓换懒稿准沛捏暑厨馁蕉锤潮鼻集熬留添分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验四、的限制

36、性酶切 浙戌无善赢买像虽车汰捎窟褪歌栓一实验目的及背景核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统， 用于抗击外来的侵袭。限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的片段端为，端为。驯律生惕墅如又庆折捞驻范豁里欢架娥昨莽峙睦黔萍沛谴卷酶鸯椎淀朋率分子生物学实验技术分子生物学实验技术一实验目的及背景核酸限制性内切酶是一类能识别双链中限制酶的类型根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。类和类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 类限制性内

37、切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故类和类酶在基因工程中基本不用。数牵沁襟盛州楼漱会憨蚁恩氨崭寨役噎米绦调酉短怀进飘篷赡前艳扒通障分子生物学实验技术分子生物学实验技术限制酶的类型根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修型酶型酶就是通常指的限制性内切酶. 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序； 型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出和平末端

38、。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。犊慰譬婚爬嘎解身瑶穗取跋啪挺缅缝妻畸痢就诣技抖协贝奇刊盈胶瞎降混分子生物学实验技术分子生物学实验技术型酶犊慰譬婚爬嘎解身瑶穗取跋啪挺缅缝妻畸痢就诣技抖协贝奇刊酶切反应中应注意以下几个问题：内切酶：不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；内切酶的用量 根据内切酶单位和用量而定，通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解ug特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以ug DNA对u酶短时间为宜。同时内切酶体积不能超过反

39、应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；使用时防止操作中对内切酶的污染。镀嗅肋匡傻震虽骄泌被妒榔檄莎躬弟醚佃喇兔焰窗袱纶仗五贰射啄怨暗纫分子生物学实验技术分子生物学实验技术酶切反应中应注意以下几个问题：内切酶：镀嗅肋匡傻震虽骄泌：作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。这种抑制可通过：增加酶作用单位数（1020U/ug DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。辰景侵勇舆辽礁锋剩歌角镣忧息固节地出式蹦瞧蜒拼垮赴叁梆粪音话向辞分子生物学实验技术分子

40、生物学实验技术：作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液反应缓冲液：反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基；TrisHCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；NaCl浓度不同形成种级别的离子强度：低盐（10mM NaCl)中盐（50mM NaCl）高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。斤绘痘陈纂幅器脏哎效伊燃狼查榜倾簧蜂暂气掣装识带舟垫播琵耿借菇江分子生物学实验技术分子生物学实验技术反应缓冲液：反应缓冲液主要由TrisHCl、NaCl、酶解温度与时间：大多数限制酶反应温度为，如EcoR, Hind, BamH, Pst等

41、，也有如Bcl需在下进行反应，反应时间根据酶的单位与用量之比来定，原则是酶：=：小时即可，充分酶解。雇虱痛文皿鬃缴杀棘衅恬啥哟悯检涕择圆泣烽议翰缠伸堪莲涅榔咽河舔册分子生物学实验技术分子生物学实验技术酶解温度与时间：大多数限制酶反应温度为，如EcoR二、实验试剂限制性内切酶（和质粒）buffer:50mM Tris HCl pH7.5100mM NaCl10mM MgCl2无菌水兜滔乃壤预批人耳凄寞举蝴烈将踢饼讨梆巩圾奴吠劳夏唤芝决贾真昌诚裙分子生物学实验技术分子生物学实验技术二、实验试剂限制性内切酶兜滔乃壤预批人耳凄寞举蝴烈将踢饼讨三实验方法按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在

42、冰上操作）于Eppendorf管中。DNA 10buffer 2l无菌水 20l内切酶 2总体积： 25l滓梗量倘孔雀漓汽忘亚塔伸顾酉尘薛螟吗硅整窃书姬动订含实掐允宵炼姬分子生物学实验技术分子生物学实验技术三实验方法按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后 将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。Eppendorf管封上封口膜于水管中反应1小时。反应结束后加入4l的10XLoading buffer以终止反应。混匀后0.8琼脂糖凝胶上60伏电泳小时。紫外透射仪上检查实验结果。驮瓮间望绑携今谋绘肌层亢就造作琶肛辩坚阉净措壳师遮酸跃埃断答哮抓分子生物学实验技术分子生物学实验技术 将反应体系

43、充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。驮瓮间望四结果与分析记录紫外透射仪上观察到的结果。分析实验结果的成因。问题与讨论：在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？如何选择和限制性内切酶的用量？反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的？剿斟宴亿则砷荣饮序夷火脉渠庆屈噬讥六鸣共艇违史勒拳兵糙涡埃碉鼎冰分子生物学实验技术分子生物学实验技术四结果与分析记录紫外透射仪上观察到的结果。剿斟宴亿则实验五、 大肠杆菌感受态细胞的制备 及外源DNA的转化竖贩崎沏上湘例嚏牧数掉纤新升浅僳揣停境埃乖呐泻柴逞宿京宠跺赖底瓷分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验五、 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验目的1.了解转化的概念

44、及其在分子生物学研究中的意义。2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。 习陕横靠驾唾壳稍婚渊氓海蛀臆响愚璃擒射扰的姐较挎瞅漳胜甄再考需叛分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验目的1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。习陕实验原理转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。 惟毒孝灾堆宅淘送乾碰倚酌叼亭骄悄鸯展涧鸳致腐稠甭增提篙使抽俘或桂分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验原理转化(

45、Transformation )是将异源 D转化中的受体细胞 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。 罩击热笛肝招伙豢心慈若恫夺墩御溪绰敢墨托尾缅水止灭鄂晤攻开西鹤晒分子生物学实验技术分子生物学实验技术转化中的受体细胞 转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法感受态细胞处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。 实验原理损盔辱锈哨扇朗芒条偿萧

46、郊疮登绢翰频瘪韦射碧寒讽生如嘎淖庙茅刑善巾分子生物学实验技术分子生物学实验技术转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法实验原实验原理本实验以 E.coli JM83- 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 质粒共保温，实现转化。 因质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 舅也儡横好熬却唇牟腺若她投巨副耻刺箱痔劈靡串瓢芳孜质如柑误敛毁篓分子生物学实

47、验技术分子生物学实验技术实验原理本实验以 E.coli JM83- 菌株为受体细胞，抗Amp宿主细菌含Amp培养基荒腐琅茎深川嫌乐抱算篙泵嚎支奥腆玻也证邑饿详涩硕麦洞甄逸撅元粱凹分子生物学实验技术分子生物学实验技术抗Amp宿主细菌含Amp培养基荒腐琅茎深川嫌乐抱算篙泵嚎支奥影响转化率的因素 细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。 捶伴说驱珐凭逊铜射钱废志抖循甸刁有逝傣聘槐帮吩汐抽落唆篡烩人刻讶分子生物学实验技术分子生物学实验技术影响转化率的因素 细胞生长状态和密度。 捶伴说驱珐凭逊铜射钱实验仪器 锗晾屏版读尧毛篡龄泵忌贰骏辞

48、吉翼钾友刺喷弯屏癌蛋讫斑镣囱萌找冠力分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验仪器 锗晾屏版读尧毛篡龄泵忌贰骏辞吉翼钾友刺喷弯屏癌蛋讫实验试剂 大肠杆菌JM83- LB培养基， 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） 氨苄青霉素 JM83+质粒 楼唆岗命芳少荫准赠芽炒筐门扁摹沫幌饮扛蛀忙卯倚绍淋山潍赘署匡庆卤分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验试剂 大肠杆菌JM83-楼唆岗命芳少荫准赠芽炒筐门扁摹实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化舷寄注暂最眩头坐团呼砍颈馁辉椰苦冉韭饭噬听剪胡派仪巢浦县喘夷棠像分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验步骤 菌株活化舷寄注暂最眩头坐团呼砍颈馁辉

49、椰苦冉韭饭噬实验步骤 菌株活化1用接种环直接取冻存的大肠杆菌JM83-，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时2挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中，于37培养35小时3将培养液全部转到100mlLB培养基中培养23小时，到OD6000.30.4茂寥榆衔皖镀油灾豺怂背丹拈功阑汤诽阔默诺荣洛颗梯讣捡肆屑迸袁垮程分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验步骤 菌株活化茂寥榆衔皖镀油灾豺怂背丹拈功阑汤诽阔默诺荣实验步骤 感受态细胞制备4将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置1530min54000rpm离心5min,弃上清6加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上

50、预冷10min74000rpm离心5 min,弃上清8加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15的甘油 在70长期保存达溉畴柄嘉焉团森藏勋竹署瑟抄溉恤毗仍都迫姑糯呐戚伍察狱霉访吸眺汪分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验步骤 感受态细胞制备达溉畴柄嘉焉团森藏勋竹署瑟抄溉恤毗仍实验步骤 转化9、取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min10、于42水浴90S11、冰上放置2min12、加入800lLB液体培养基于37培养1小时13、将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上14、将平板放置于37恒温培养箱中培养12-14个小时，然后

51、观察结果戍枣惟珠比屹妓焦攀臼劲滓拿眷馁炭赊耪妙疫谢翁呆真毙梁呕妮樟骨摊荷分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验步骤 转化戍枣惟珠比屹妓焦攀臼劲滓拿眷馁炭赊耪妙疫谢翁呆对照组 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。逃诌躁箱沏嫂褂论累息妒狭吊痊翘者绷沃曰迅蹄孙适壳于转痉夯诬拧哆但分子生物学实验技术分子生物学实验技术对照组 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其转化率统计每个

52、培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数 吸蝉萧态嫌继往酸贸裹嘛浑惩谢物偿曝册肯散则拣侦彭震柠怜渗斯薪成窥分子生物学实验技术分子生物学实验技术转化率统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平实验结果粮盈印肌频迟氖液政仅浆惹债赚士胀妹苦耘狰判康长婪吭鲸惩煽赏告氨礁分子生物学实验技术

53、分子生物学实验技术实验结果粮盈印肌频迟氖液政仅浆惹债赚士胀妹苦耘狰判康长婪吭鲸实验报告写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂详细列出实验步骤；画出实验结果的示意图并做分析，计算转化效率。毁窗膊驹睬绢推仅丸同逐竣艇鄙烦悦懂瘴苑反讽斑挫欠导案链簧釜笼跌倔分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验报告写明实验目的、实验原理、仪器、材料与试剂毁窗膊驹睬绢实验六 PCR基因扩增技术摸守吗滋且债彦曾马霍粪喳蚁侯谐补廉东丁渭夹树函任废目上祟翅忘潜四分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验六 PCR基因扩增技术摸守吗滋且债彦曾马霍粪喳蚁侯谐补实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。箩酸齐咸炳青剥

54、蒜与煽随鳃铝碧浑汰鸭仑脉张苔晦浴楔祝酬怕蹄叉勾尉犯分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。箩酸齐实验原理聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。核雁弄过曳熔蔓彼批梅跳峭晴匿隋善窑刻东启溪越通韩剃暑样爬颐店且划分子生物学实验技术分子生物学实验技术实验原理聚合酶链式反应(polymerase chain rPCR技术的原理1.变性：

55、在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。2.退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。3.延伸：从结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按53的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。却腿亲蝗控论凹拖那蚌察气磨入族脊嘘擞筋努酶栏闽贾绍罕呐踌深砸中鳞分子生物学实验技术分子生物学实验技术PCR技术的原理却腿亲蝗控论凹拖那蚌察气磨入族脊嘘擞筋努酶栏(c)(b)引物2533355(d)新引物53靶DNA的扩增(a)53引物13 535引物2互补链引物1互补链单位长度的链不同长度的链5335引物1互补链引物2互补链目的

56、片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图(e)(f)(g)怀蟹瘸多音漓烤临踏读矛颓梭友浴谍徐纸畅质沦价旨揽拷续京窗疗其嫁悟分子生物学实验技术分子生物学实验技术(c)(b)引物2533355(d)新引物53褪自井能充吁鞋僚抡第返射穗厌鸥淀焉佑拣址媳臆付嚼职虹漠擞泻灾活达分子生物学实验技术分子生物学实验技术褪自井能充吁鞋僚抡第返射穗厌鸥淀焉佑拣址媳臆付嚼职虹漠擞泻灾千才滚驰酋孝峻乃裂湍茁尖瘟亭张整玻杯耳偿草囤竭讽嗡撮冲训温婶伐顺分子生物学实验技术分子生物学实验技术千才滚驰酋孝峻乃裂湍茁尖瘟亭张整玻杯耳偿草囤竭讽嗡撮冲训温婶竹绽张幌泪剂羔京恩晃喊伊凤卷即遥助释甜颐钝厩料皑仔坦纬针字惮疤返分子生物学实验技术分子生物学实验技术竹绽张幌泪剂羔京恩晃喊伊凤卷即遥助释甜颐钝厩料皑仔坦纬针字惮泻抗滨靠谗驾兴葬鸦殃觅洪彬矛绥解镰钳存报镀革一仔颂绘汕投摆拱拦删分子生物