中药化学 第二单元 分离追踪有效成分课件

1、药理活性指导下提取分离追踪有效成分方法：常采用递增极性的溶剂法对中药材进行提取，对每部分均进行活性测试，确定有效部位。然后在药理活性指导下进一步分离 采用水溶液提取，然后采用递增极性的溶剂萃取或色谱分离成若干部分进行活性测试，确定有效部位。采用7095%的乙醇回流提取，然后回收乙醇补加水至（1：1）体积再分别采用递增极性的溶剂萃取分离成几大部分进行活性测试，确定有效部位。注意事项：1.生物科研设计的原则：对照、重复和随机。 2.正确选择活性测试方法3.确保供试材料具有活性 4.中药的多方面的活性5.在分离过程中要注意量效关系.6.药理实验与临床疗效不平行的问题 正确选择活性测试方法活性测试方法

2、选择的正确与否是活性追踪分离能否取得成功的关键。常用的活性测试方法有:整体动物、动物的器官、组织、细胞、酶、受体以及药物对体内某些生物活性物质的抑制或促进等。 无疑采用整体动物进行试验与人比较相近，但所需实验费用很大、现象复杂、时间长加以动物个体差异以及病理模型难于建立等因素，实际上用其指导活性追踪分离难于做到。一般最好的方法是: 寻找活性部位时-用整体动物试验 追踪分离成分 -选用体外的方法 理想的体外活性测试方法应具有简易、快速、不需特殊设备、方便、抗干扰性强、假阳性和假阴性均较低、临床相关性强等优点，但在实际工作中理想的活性测试方法往往很难找到，只有综合分析考虑，根据实际情况、条件以及研

3、究开发的课题选择较理想的活性测试方法。同时也要根据实践经验积累和科学技术的发展，改进现有的一些活性测试方法和建立一些新的活性测试方法。中药有效成份的活性评价技术进展简介高通量药物筛选 (High throughput screening,HTS)技术生物芯片(biological chip or biochip)技术亲和层析(affinity chromatography)技术血清药理学(Plasma pharmacology) 高通量药物筛选(High throughput screening,HTS) 此技术是20世纪80年代后期发展起来的一种寻找新药物的高新技术,它是将多种技术方法有机结

4、合而形成的新技术体系,是以分子水平和细胞水平的实验方法为基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行试验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实验数据,以计算机对数据进行分析处理,可在同一时间对数以千、万计的样本进行检测,并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。生物芯片(biological chip or biochip) 自从1991年美国stephen fodor等提出DNA芯片概念,随着人类基因组计划(HumanGenome Project,HGP)的实施,生物芯片技术已成为基因组计划中的一种重要技术手段。此技术采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量生物大分子如核酸片段、多肽分

5、子、甚至组织切片、细胞等生物样品,有序固化于玻片、硅片、尼龙膜等载体作为支持物的表面,组成密集二维分子排列,与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交,通过特定检测器对杂交后芯片上标记信号的强度进行快速、并行、高效检测分析,从而判断样品中靶分子的数量。生物芯片把生化分析系统中的样品制备、生化反应和结果检测三个部分有机地结合起来连续完成。 依据芯片探针的不同,生物芯片可分为: 1.基因芯片 2.蛋白质芯片 3.芯片实验室。应用： 目前,在中药研究中应用最多的是基因芯片和蛋白质芯片。 利用基因芯片技术可以了解正常组织与疾病组织基因表达谱的差异,基因表达的增加或减少可能就是病生理的原因或结果,引起疾病的多

6、个基因产物可作为药物作用的靶分子,通过使表达异常的基因恢复正常表达或使异常减轻可以指导药物筛选; 通过分析用药前后机体的不同组织、器官基因表达谱的变化,可找出靶基因及受到靶基因调控的基因,并能研究是否影响其他基因的表达而带的毒副作用。 蛋白质芯片是利用肽或蛋白质能特异性与配体分子(如抗原和抗体)结合的原理制备而成,它可以将肽或蛋白质固定到膜上制成肽芯片,与样品发生反应后加入标记分子,然后用阅读仪来分析结果。蛋白质芯片可用于多肽类药物的筛选。 我国开展生物芯片研究时间不长,但已有众多大学开展生物芯片研制,如:清华大学、北京大学、第一军医大学等;也诞生了多家生物芯片公司,如:上海博华、北京奥博及北

7、京国家生物芯片研究中心等。如北京国家生物芯片研究中心采用自行研制的酵母全基因组DNA芯片,与北京大学药学院合作研究多种抗真菌中药。 世界上一些大型制药公司将生物芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、药物筛选.亲和层析(affinity chromatograph) 亲和层析,又称生物选择性吸附层析,是以目标生物分子与其它分子的特异和可逆的结合能力为基础,将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中,当要被分离的生物分子混合液通过层析柱时,与吸附剂具有亲和能力的生物分子就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的生物分子由于不被吸附,直接流出,从而与被分离的生物分子分开,然后选用适当的洗脱

8、液,改变结合条件将被结合的生物分子洗脱下来。亲和层析是至今最有效的生物活性物质纯化技术。对于自然界成本相对较低,如人血液、尿、动物器官、蛇毒等,采集成本相对较低,可直接进行高效分离纯化。应用： 正因亲合层析的选择性强、操作简便、分离时间短而效率高,且一般不损坏生物高分子的生物活性,所以,受到人们的普遍青睐,尤其适用于蛋白质,如酶、抗原、抗体、肽类激素、受体及转运蛋白等的分离纯化。 目前,国内开发的蚓激酶口服液溶栓药物含有大量的杂蛋白,影响药效的发挥。利用亲和层析技术一步提取出全部溶栓成份,质量和收率在国内领先。陈登鸿等研究了单克隆抗体亲和层析一步纯化重组人生长激素。又如我国首次从银纹夜蛾幼虫血

9、淋巴中采用亲和层析法获得纯度高达98%的具生物活性的rhlL-12,从而使该研究达到国际领先水平。我国从1991年开始对亲和配基进行研究,目前 已有数百种亲和介质和数万种亲和配基可供选用和优化,研究和技术水平与世界同步。血清药理学(Plasma Pharmacology) 1984年日本学者Hiroko Iwama首次提出此概念;1988年日本学者田代真一正式提出“血清药理学”的概念。 血清药理学是指给动物灌服中药,在一定时间里,取其血清进行实验,它是一种新的药理学尤其是中药药理学的实验方法。应用: 中药血清药理学在1990年以后才开始在我国受到重视,目前,中药血清药理学的应用处于探讨阶段。尽

10、管中药血清药理学的应用尚存许多问题,但在复方药理学研究中具有不可替代的作用。 目前,中药血清药理学方法的应用领域主要在抗自由基、抗肿瘤、抗病毒、抗菌实验等体外实验上;此外,中药血清药理学在中药的药效学、药动学、药剂学及药理学方面有广阔的应用前景,必将在中药的现代化研究中发挥积极的作用。确保供试材料具有活性确保供试材料具有活性是能够追踪到活性化合物的前提。在活性追踪分离之前一定要采用体内、体外多种方法，多个指标对实验材料进行活性测试，其目的第一是再次确证实验材料的活性，确定有无进一步研究的价值；二是为选择活性追踪分离所用的活性测试方法提供依据。上面的流程是美国癌症研究中心(NCl)用于筛选确认植

11、物或动物粗提物抗肿瘤活性的改进力案，可供工作时参考。通过该方案确认的实验材料至少有以下三个优点： 不至于丢失活性低或含量少的化合物 增加了分离出新化合物的机会； 有可能分离到具有不同作用机理或新的 作用机理的化合物。中药的多方面的活性中药在临床上往往具有多方面的治疗作用，在动物实验上具有多方面的活性，在体外实验中具有多个作用靶点。多组分、多靶位、多因素、多环节研究者应当从这些杂乱的实验现象中找出其中最本质的作用，选择建立能反映临床治疗特点且效果与之平行的活性测试体系才有可能追踪分离出有开发价值的活性成分及先导化合物。在分离过程中要注意量效关系在分离过程中要按“等剂量不等强度原则”对每一阶段所得

12、组分进行活性定量评估并与母体进行比较，追踪分离活性最强的馏分。通常： 1如与母体比较所得几个组分活性强弱参差不齐，则说明活性分离与物质分离平行，预示可能获得良好的分离效果； 2如果某个组分活性显著增强，则说明在分离过程中可能除去了某种具有拮抗作用的物质； 3如果所得各组分活性均明显减弱，即使将其合并，其活性与母体相比也大大减弱，则提示活性成分可能发生分解、破坏或产生了不可逆吸附； 4如果所得各组分分别测试其活性虽然明显降低，但将其合并后其活性与母体相当则提示是活性成分被分散或该药中的成分存在明显的协同作用(相加或相乘)，故分离后导致活性的减弱或消失。药理实验与临床疗效不平行的问题 由于一个药物

13、疗效的发挥并不只取决于它与药物靶点的作用强弱，还与它的吸收、分布、代谢、排泄、到达靶点的浓度及持续时间、体内对外影响的综合平衡能力等有关因素，所以体外活性测试方法所得结果与药物在体内实际作用并不平行。即使是动物整体实验，由于种族的差异以及病理模型与临床上的实际病症并不完全一样，所以也存在动物实验与临床疗效不平行的问题故在实践工作中应予以注意。中药化学成分研究的预试验在提取分离某种中药成分之前或者经中药药理筛选找出有效部位之后，一般进行简单的预试验，初步了解其中可能含有哪些类型的成分，以便根据这些化合物的类型和性质作定向提取分离或者寻找指示提取分离的显色剂和定性试剂。常用的方法有试管法，纸片斑点

14、法圆形滤纸径向层析法三种。圆形滤纸径向层析法操作方法: 1.预试样品溶液的制备 2.点样 3.展开 4.显色 1.预试样品溶液的制备 较常采用的为递增极性的溶剂法，就是根据中草药成分亲脂性强弱的程度，选择各种极性不同的溶剂，依次进行提取，使分为若干部分。例如常将中草药原料依次用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、水等溶剂进行提取.1.预试样品溶液的制备 (1)水浸液： 取中药粉末4g加40m1蒸馏水浸泡过夜，滤取3ml滤液供检查氨基酸、多肽和蛋白质，其余部分在60水浴中加热约10分钟，取滤液供糖类、有机酸、皂甙、酚甙类、鞣质及水溶性生物碱的捡查。(2)中性醇提取液： 取中药粉末5g，加60m

15、1 95%乙醇在水浴中加热回梳20分钟,滤过,滤液供黄酮、蒽醌、香豆素、萜类、甾体和挥发油类的检查。(3)酸性醇提取液： 取中药粉末2g，加含05%盐酸的乙醇液10mI，水浴上回流10分钟，滤过，滤液供生物碱检查用。2.点样 取直径约13cm的整洁圆形层析滤纸一张，中心打一直径约45mm的小孔，用铅笔将滤纸划分为若干等分(6，8或10等分均可)并在距中心孔lcm处用阿拉伯数字或x标记原点位置；(点样时可点成弧状；也可点成圆点)然后用毛细管(或微量注射器)，在原点分别点上前述的三种样品溶液(可重复点样23次)展开 点样后在滤纸中心孔插入滤纸芯,移到盛有展开剂的培养皿(直径12cm)上，上扣一个同

16、样大小的培养皿。待溶剂前沿到达滤纸边缘时，取下滤纸立即标记溶剂前沿位置通用展开剂: 可选用正丁醇-醋酸-水(4：1：5) 或95%乙醇。专用展开剂有： (1)生物碱常选用氯仿甲醇(96:4)。 (2)黄酮类化合物常选用15%醋酸。 (3)皂甙、强心甙、氨基酸多选用正丁醇醋酸水(4： 1:1)。 (4)极性小的其它成分可选用苯无水乙醇(8：2)。显色 溶剂挥干后沿铅笔划分的等分线剪开，分别用后述的显色剂喷雾显色，干后或加热后观察有无色斑,并按下式计算比移植(Rf值)。根据斑点的颜点及Rf值可作为化合物的初步定性鉴别。注： 1.若作单项预试可按图线剪开后喷雾一种或一类显色剂即可. 2.若作系统预试

17、可按上述方法多作几张圆形层析图后按铅笔划分的等分线剪开，分别喷上各种显色剂。显色剂与结果判断: 1。检查生物碱，用碘化铋钾试剂显色，如呈棕红色斑点为正反应。 2检查酚性成分。用2%FeCl3乙醇液与2%铁氰化钾水溶液，临用时等量混合喷雾显色，如呈蓝色斑点为正反应。 3检查有机酸可用01%溴酚兰试剂如在蓝色背景上显黄色斑点为正反应 4。检查植物甾醇；甾体皂甙、三萜皂甙可用： (1) 用新配制的5%磷钼酸乙醇液喷洒，并于120烘至显色，如显蓝色蓝紫色斑点为正反应。 (2)用1%硫酸锌试剂或10%硫酸试剂喷洒,并于95110加热2、5分钟，因结构不同颜色各异，呈淡红色、棕红色，紫红色、绿色或蓝色等(限薄层板使用)。5检查内酯: 香豆精类可用异羟肟酸铁喷洒，如呈蓝色、紫色斑点为正反应。6检查黄酮类成分: