高效液相色谱分析技术-方法开发课件

1、高效液相色谱分析技术方法开发课件高效液相色谱分析技术方法开发课件方法开发 方法开发过程是指为分析样品选择合适的方法条件。这建立在预先了解样品的性质、功能团的pKa或pKb值、溶质分子的极性和大小、紫外可见光谱性质、氧化还原行为、浓度范围、溶解度以及其它方面的基础之上。根据这些知识，就可以选择合适的色谱模式、相应色谱柱、流动相组分、流速、检测器选择、梯度或等度洗脱条件和其它条件。经初步试验，一旦方法建立，就可以进行优化工作。优化是非常必要的，可以使所用组分在尽可能短的时间内，或者在低检测限下实现最佳分离，优化后的条件可以达到检测要求或定量要求。 方法开发 方法开发过程是指为分析样品选择合适的方法

2、条件。这建建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题： 根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。 选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。 选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。 由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 通常在确定被分析的样品以分析物理化性质混合分析物的主要差异分子结构和特性分析物理化性质高效液相色谱分析技术方法开发课件方法开发前要确定的基本问题1、分析物的物理、化学性质样品基质-决定

3、前处理方法溶解性-决定正、反相方法酸碱性-确定色谱柱类型、流动相组成pKa-确定流动相的pH值化学结构、特征官能团、Etc.方法开发前要确定的基本问题方法开发前要确定的基本问题2、混合分析物的主要差异疏水性差异-用疏水性选择性强的色谱柱极性差异-用具有极性选择性的色谱柱芳香性差异-用芳香选择性色谱柱混合差异-用多种选择型色谱柱分子量差异-GPC、GFC方法开发前要确定的基本问题方法开发前要确定的基本问题3、分子结构决定选用何种分析方法HPLC-UVHPLC-IRHPLC-MSHPLC-ELSDEtc.方法开发前要确定的基本问题如何得到最理想的分析结果流动相,被分析物,和固定相三者之间的作用影响

4、峰保留时间和峰分离性.峰保留时间短一般峰型较好,但分离可能不理想.所以为了调节最理想的分析结果,可以改变下列的一项或数项条件: 流动相 固定相 pH 温度如何得到最理想的分析结果流动相,被分析物,和固定相三者之间的如何选择适当的色谱柱理想的柱子可以适用于分析所有的化合物永远不会坏理想分离度如何选择适当的色谱柱理想的柱子可以适用于分析所有的化合物永决定峰分离度的三个要素 峰保留时间 选择性(出峰的顺序) 柱效决定峰分离度的三个要素 峰保留时间 选择性(出峰的顺序) 柱固定相的选择 疏水性的选择 极性的选择 苯基的选择固定相的选择 疏水性的选择 极性的选择 苯基的选择固定相疏水性考虑的要素 键合相

5、的种类 (C18, C8, Phenyl, etc) 表面积 键合相的键合率固定相疏水性考虑的要素 表面积 键合相的键合率色谱柱选择表颗粒直径及形状(球型及不规则型)柱长及柱内径表面积及孔径碳负荷及键合类型色谱柱选择表颗粒直径及形状(球型及不规则型)Luna C18(2)Ginseng RootColumn:Luna 5 m C18 / ODS (2)Dimensions:150 x 4.6 mm IDElution Type:GradientEluent A:Acetonitrile/water (15:85)Eluent B:Acetonitrile/water (80:20)Flow R

6、ate:1.5 mL/minTemperature:25 CDetection:UV-Vis Abs. Variable Wave. 205 nm App ID 1125Luna C18(2)Ginseng RootApp ID高效液相色谱分析技术方法开发课件Luna C8(2) & C5 减少疏水性化合物的保留时间减少分析的时间Luna C8(2) & C5 减少疏水性化合物的保留时间Synergi Max-RP 疏水性和 C18柱类似 为一支C12柱提供比C18柱更尖的柱峰,尤其是分析碱性化合物Synergi Max-RP 疏水性和 C18柱类似 Synergi Max-RPBasic D

7、rugs at Neutral pHSynergi Max-RPBasic Drugs at 疏水性的比较C18 phasesC8 phase300 C18 phase疏水性的比较C18 phasesC8 phase300 C极性选择性的考虑首先考虑 固定相的极性封尾,封端基团 分析物的极性官能基之间的作用极性选择性的考虑首先考虑极性选择性如何增加极性的选择性 极性基团封端 极性基团镶嵌 苯基极性选择性如何增加极性的选择性极性选择性Columns: Luna 5m C18(2)YMC-Pack 5m Pro C18Synergi 4m Polar-RP (Ether-linked Phenyl

8、)150 x4.6mmMobile phase:75:25 Methanol:waterFlow rate:1 mL/minComponents:1. Estrone2. Estradiol极性选择性Columns: Luna 5m C18(2极性选择性Luna C18(2)Synergi Polar-RPYMC-Pack Pro C181+21+212极性选择性Luna C18(2)Synergi PolaSynergi Max-RP - C12Synergi Hydro-RP - C18Synergi Fusion-RP C18Synergi Polar-RP PhenylSynergiS

9、ynergi Max-RP - C12SynergiSilica Advantage Balancing Efficiency & BackpressureLinear Velocity (mm/sec)Plate Height (H)5 43 Flow Rate (mL/min)Pressure Drop (Bar)higher efficiencieslower backpressuresSynergiSilica Advantage BalanSynergi Max-RP与C18柱性能类似的C12柱Synergi Max-RP与C18柱性能类似的C12柱Synergi Polar-RP

10、保留极性和苯基化合物 100% 水溶液稳定 增加极性的选择性Synergi Polar-RP 保留极性和苯基化合物 Synergi Hydro-RP 疏水性非常强 极性封端100%水溶性稳定 增进极性的选择性Synergi Hydro-RP 疏水性非常强 极性封端Synergi Hydro-RP VS. Luna C18(2)Synergi Hydro-RPSynergi Hydro-RP VS. Luna C18 Synergi Hydro-RPSynergi Max-RPMobile Phase:A: 20mM KH2PO4, pH 4.6B: AcetonitrileGradient:

11、A/B (95:5) to A/B (65:35) in 15 minFlow rate: 1.5 mL/minSample:1. Morphine2. Hydromorphone3. Codeine4. Nalorphine5. OxycodoneSynergi Hydro-RP Synergi Hydro-RPSynergi Max-RSynergi Fusion-RP 增加极性的选择性同时减少疏水性的分析时间 在水溶液中100%稳定Synergi Fusion-RP 增加极性的选择性同时min02468101214mAU 0100200300400500 VWD1 A, Waveleng

12、th=210 nm (S:HPCHEM1DATASW1003TEST0034.D)min02468101214mAU 050100150200250300350 VWD1 A, Wavelength=210 nm (S:HPCHEM1DATASW1003FUSI0046.D)Running ConditionsMobile phase: 75:25 20mM Potassium phosphate pH 2.5: AcetonitrileFlow rate: 1.5 ml/minTemperature: AmbientDetection: 210nmInjection: 1. Maleic a

13、cid2. Chlorpheniramine 3. Triprolidine 4. Diphenhydramine Synergi Fusion-RP 4 80一般的 C18柱极性增大疏水性减少min02468101214mAU 0100200300Synergi Fusion-RPAvg symm: 0.91Synergi Max-RPAvg symm: 0.77Luna C18(2)Avg symm: 0.82 Running ConditionsMobile phase: A: 25mM Tris pH 9 B:ACNGradient:40%-70% B in 15 minutesFlo

14、w rate: 1.0 ml/minDetection: 230nmComponents:1. Scopolamine, LogP = 2. Lidocaine, LogP = 2.443. Noscapine, LogP = 1.97Synergi Fusion-RPSynergi Max-苯基的选择性影响 被分析物和固定相之间产生的作用LunaPhenyl-Hexyl 使用甲醇可以增加作用效果苯基的选择性影响 被分析物和固定相之间产生的作用Luna Phenyl-Hexyl 具有疏水性和苯基双重的选择性 重复性高和稳定的苯基固定相Luna Phenyl-Hexyl 具有疏水性和苯基双重的L

15、una Phenyl-HexylGreen Tea(绿茶)Column: Luna 5u Phenyl-HexylDimensions: 250 x 4.6mmMobile Phase A:0.2% Acetic acid in Water/Acetonitrile (91:9)B:Water/Acetonitrile (20:80)Gradient: 100%A to t=25min, (68:32) t=25min to t=35min, hold 100%B for 10 min.Flow Rate: 1ml/minTemperature: 350CApp ID 14436Luna Ph

16、enyl-HexylGreen Tea(绿茶苯基的影响Columns: Luna 5m C18(2) 150 x4.6mmLuna5m Phenyl-Hexyl 150 x4.6mmSynergi 4mm Polar-RP150 x4.6mmMobile phase:50:50 Acetonitrile:20mM Potassium phosphate pH 2.5Flow rate:1.0 mL/minComponents:Acidic, aromatic compounds 1. Indoprofen2. Ethyl paraben3. Naproxen4. Diflunisal5. In

17、domethacin6. Ibuprofen苯基的影响Columns: Luna 5m C18(2C18(2)Phenyl-HexylPolar-RP苯基的影响苯基的影响pH的影响当选择流动相的pH时,我们必需考虑到pH对分析物和柱子两者的影响pH的影响当选择流动相的pH时,我们必需考虑到pH对分析物和pH对柱子的影响即使键合完美,封端完好,硅胶表面还是会存在Si-O-H的微酸游离基 pKa3.5如果流动相的pH是4以上,此 Si-O-H的游离基会脱氢, 成为带负电的Si-O-(这会造成和分析物之间的极性反应,而造成峰拖尾)如果流动相的pH是8(或10)以上,硅胶会被破坏,造成柱子损害pH对柱

18、子的影响即使键合完美,封端完好,硅胶表面还是会存在SpH对分析物的影响基本上,反相柱的峰保留时间长短,主要归因于疏水性的非极性反应.所以要增长峰保留时间,必需选择流动相的pH能够让分析物保持中性对酸性分析物(pKa3-6),基本选择pH在 pKa以下对碱性分析物(pKa9-11),基本选择pH在 pKa以上pH对分析物的影响基本上,反相柱的峰保留时间长短,主要归因于对碱性分析物的分析建议多数硅胶柱没法于高pH条件下稳定,所以一般分析碱性化合物时,会选择于pH1.5-3下进行分析.在此pH条件下,硅胶表面的游离Si-O-H会保持中性,减少离子间的二极反应,因而减少峰拖尾,峰型较好但是在低pH条件

19、下,碱性化合物的极性增加,疏水性减少,如果要增加峰保留时间,流动相的有机溶剂比率必需减少对碱性分析物的分析建议多数硅胶柱没法于高pH条件下稳定,所以对碱性分析物的分析建议在高pH条件下,碱性化合物可以保持中性,疏水性因而增加,但是如果峰保留时间太长,可以将流动相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间.增加选择分析条件的弹性流动相的有机溶剂比率增加,以缩短保留时间外,并可以增进峰型(尖)但是问题是:如何在高pH (8以上)条件下分析?对碱性分析物的分析建议在高pH条件下,碱性化合物可以保持中性高pH对碱性分析物的分析选择使用高分子柱使用双子星柱(GEMINI)高pH对碱性分析物的分析选择使用高分子柱

20、使用双子星柱(GEMGemini C18 双子星柱在pH 1-12范围内很稳定；适用于酸,中,碱性化合物,特别是分析中碱性化合物很理想；可以更有弹性的调节pH以得到合适的分析条件。Gemini C18 双子星柱在pH 1-12范围内很Gemini C18Gemini C18流动相pH的影响pH 1 12 Stability流动相pH的影响pH 1 12 StabilityGemini C18Gemini C18pKapKapKapKa 硅胶纯度（金属含量）Columns: A型硅胶 ( = 旧型号)B型硅胶 (Gemini 5m C18)Mobile phase:10mM 甲酸铵 pH 3.5

21、 : 乙腈: 甲醇（ 35:15:50 ）Flow rate:1.0 mL/minComponents:1.Rhodamine 123 2. Rhodamine 6G3. Rhodamine B Base玫瑰精, 若丹明(一种红色荧光染料) 硅胶纯度（金属含量）高效液相色谱分析技术方法开发课件色谱图A型硅胶C18化合物被吸收B型硅胶 （Gemini C18)峰形、峰高、分离正常色谱图金属的影响（1）金属的影响（1）金属的影响（2）金属的影响（2）流动相的选择有机相的选择缓冲液的选择离子对的选择程序洗脱其他流动相的选择有机相的选择流动相中有机相的选择* 甲醇：洗脱能力较弱，压力较大；使用苯基柱时推荐使用。* 乙腈：洗脱能力较强，压力较小；使用末端吸收时和梯度洗脱时推荐使用。*梯度时：流动相中有机相的选择高效液相色谱分析技术方法开发课件缓冲液pH值的选择酸性分析物：pHpKa-2单一碱性分析物：pH3.5 或pHpKa+2复杂碱性混合物：pHpKa+2缓冲液pH值的选择高效液相色谱分析技术方法开发课件 1.氯磺丙脲（pKa5.0) 2.对羟基苯甲酸丁酯 3.利多卡因（pKa 7.9) 4.苯丙烯啶（pKa6.5) 5.右甲吗南(pKa 9.2) 应用实例：苦参色谱柱：Gemini C18 5u 250 x4.6mm流动相：0.01M醋酸铵-乙